邱昌俊 渾婷婷 趙瑩彤 詹悅維 趙 峰 孫 艷*

1(北京航空航天大學生物與醫(yī)學工程學院，生物力學與力生物學教育部重點實驗室，北京 100191)2(中國科學院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所，傳感技術(shù)聯(lián)合國家重點實驗室，上海 200050)

引言

體外條件下成肌細胞能否獲平行排列是其分化成功能性肌管的關(guān)鍵[1-2]。已有研究表明，成肌細胞會以端對端的形式融合并形成線性的肌纖維，而細胞的側(cè)向融合受到限制。但是，細胞的側(cè)向相互作用和端對端作用都對細胞融合有影響，如果限制了側(cè)向移動，細胞的融合將受到限制[3]。線性排列的成肌細胞比自由生長的成肌細胞的分化顯著增加[4]。條帶狀的細胞排列不僅能使肌管排列方向得到類似于體內(nèi)的平行排列，而且使成肌細胞的分化效率得到明顯提高，包括抑制增殖、促進細胞退出分裂周期進入分化階段、提高成肌細胞融合系數(shù)、延長肌管等特點[5-6]。然而，對于如何實現(xiàn)成肌細胞的最佳排列和分化仍然有許多問題亟待解決，細胞水平下的融合機制尚不清楚。

FN(Fibronectin)作為細胞外基質(zhì)，能促進細胞的黏附、增殖、分化等過程[7-9]。微接觸印刷技術(shù)則為研究細胞與細胞之間多方面的關(guān)系，提供了一個有效的實驗方法[10]。利用微接觸印刷技術(shù)，可以在基底上形成特定的FN微圖案，從而進一步調(diào)控成肌細胞的排列，促使單核的成肌細胞按照預期情況互相識別、配對、粘連并融合，得到平行排布的多核肌纖維[11]。然而，成肌細胞融合與分化的內(nèi)在機制尚不明確。

本實驗通過設計不同類型極性排列的FN微圖案，研究了不同極性排列的FN基底微圖案對小鼠成肌分化、細胞微絲的分布和骨架重排以及細胞黏附的影響，為進一步探索如何實現(xiàn)二維微圖案技術(shù)精密控制細胞排列充實了理論依據(jù)。

1 方法

1.1 材料和設備

PDMS Sylgard 184(Dow Corning)，DMEM高糖培養(yǎng)基(Corning)，胎牛血清(HyClone)，馬血清(HyClone)，人纖維粘連蛋白(Corning，貨號356008)，Alexa Fluor 488標記的羊抗鼠IgG(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，DAPI染色液(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，Monoclonal Anti-Vinculin Antibody(Invitrogen)，實驗中所用其他試劑除特殊說明外，均購自美國Sigma公司；小鼠骨骼肌成肌細胞C2C12，購自美國模式培養(yǎng)物寄存庫ATCC(CRL-1772TM)。

激光直寫光刻設備(Heidelberg Instruments)，脫泡攪拌機(Thinky)，臺式勻膠機(中國科學院微電子所, 中國)，不銹鋼電熱板(金壇市天竟實驗儀器廠，中國)，倒置熒光顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 實驗過程

1.2.1蛋白微圖案基底的制備

本實驗使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)彈性印章，并通過微接觸印刷技術(shù)在PDMS薄膜上成功制備了蛋白(本實驗為fibronectin, FN)微圖案，圖1所示為微接觸印刷技術(shù)的操作流程。

圖1 微接觸印刷技術(shù)的操作流程Fig.1 The protocol of microcontact printing technique

首先，通過激光直寫設備制備，具有微圖案的光刻膠基底；然后，將PDMS前聚物與交聯(lián)劑以10∶1的比例加入杯具，放入脫泡攪拌機中配平，并以2 000 r/min，混勻2 min，除泡2 min。在光刻膠基底上倒入適量的PDMS，并置于電熱板上，以65℃固化12 h，再將固化后的PDMS剝離，切割出所需要的微圖案印章。

對于PDMS薄膜的制備，先將直徑為25 mm的玻璃基片進行超聲清洗，用丙酮、75%乙醇、去離子水依次清洗5 min。干燥后，取適量PDMS滴在蓋玻片上，以1 000 r/min預旋涂10 s，隨后以4 000 r/min旋涂60 s，最終在玻璃基片上形成厚度為15 μm的PDMS薄膜，再將薄膜加熱固化，其固化條件與PDMS印章制備相同。最后，通過微接觸印刷技術(shù)將蛋白微圖案轉(zhuǎn)移到PDMS薄膜上，形成蛋白微圖案。

1.2.2細胞在蛋白微圖案基底上的黏附及分化

取生長狀態(tài)良好的P5代C2C12成肌細胞，消化后計數(shù)。調(diào)整細胞濃度至5×104個/mL，將細胞接種到轉(zhuǎn)印有蛋白的微圖案基底上，置于5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別在2、4、6、12、18 h利用熒光染色法觀察細胞的鋪展和黏附；調(diào)整細胞接種濃度至2×105個/mL，在5% CO2、37℃，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，待細胞生長至90%以上開始融合時，將含10%胎牛血清的培養(yǎng)液更換為2%馬血清的培養(yǎng)基誘導分化，持續(xù)培養(yǎng)7 d后，進行免疫熒光染色。

免疫熒光染色法步驟如下：37℃的PBS清洗細胞，棄去PBS溶液，再分別加入濃度為4%的多聚甲醛對細胞進行固定，濃度為0.01 M的PBS溶液清洗細胞3次，每次5 min。加入濃度為0.1%的Triton X-100溶液處理15 min，用1% BSA/PBS溶液封閉1 h。再分別用抗MHC和vinculin的抗體(1∶200)室溫孵育1 h后， PBS清洗細胞3次，每次5 min。然后加對應的二抗(1∶100)、羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽(1∶100)、DAPI(1∶1 000)，小心混勻。室溫下避光孵育1 h。染色結(jié)束后，使用濃度為0.01 M的PBS洗細胞3次，每次5 min，并用倒置熒光顯微鏡觀察細胞拍照記錄。

1.2.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

蛋白染色圖像利用Image J軟件幾何參數(shù)測量，并對肌管形成數(shù)量進行了統(tǒng)計分析。每個實驗重復3次，實驗結(jié)果用均數(shù)±標準差表示。采用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件One-way ANOVA進行方差分析和顯著性檢驗。

細胞骨架圖像利用Matlab軟件，模擬分析肌動蛋白纖維絲矢量與整體微圖案排列方向之間的夾角，并將微絲向量的分布頻率繪制成直方圖。

2 結(jié)果

2.1 微圖案的設計與基底的制備

有研究表明，線性排列(條帶狀)的成肌細胞比自由生長的成肌細胞的分化顯著增加[12]。當成肌細胞在面積為10 μm×200 μm的長方形微圖案上培養(yǎng)時，分化的成肌細胞較多，而當成肌細胞在面積為2000 μm2的圓形微圖案上培養(yǎng)時，分化的成肌細胞較少[13]。本課題組的前期實驗證明：微圖案寬度為10 μm的幾何圖案對于成肌細胞生長寬度太窄，20～50 μm更適合成肌細胞生長和分化[14]，因此選擇40 μm寬度的微圖案，更適合C2C12細胞融合形成肌管，且足夠?qū)?，能滿足成肌細胞生長所需；同時足夠窄，能有效的引導細胞在蛋白微圖案上有序生長，遷移和融合[16-17]。

本實驗一共設計了3種極性排列條帶微圖案和40 μm寬條帶作為對照，微圖案整體為條帶狀圖案，如圖2所示。微圖案條帶總寬度為40 μm，條帶之間的間距為50 μm。各組微圖案之間均為橫向陣列排列，每組微圖案面積均為36 mm2(6 mm×6 mm)。

圖2 微圖案的設計。(a)平行組(PG)，10 μm×40 μm；(b)隨機組(RG)，10 μm×10 μm；(c)垂直組(VG)， 40 μm×10 μm；(d)對照組(CG)Fig.2 The designed polarity arrangement micropattern. (a) Parallel group(PG), 10 μm×40 μm；(b) Random group(RG), 10 μm×10 μm；(c) Vertical group(VG), 40 μm×10 μm；(d) Control group(CG)

極性排列微圖案的具體參數(shù)如下：10 μm×40 μm的長方形，其極性方向平行于整體條帶方向，即平行排列組，以下均簡稱為平行組(parallel group，PG)(見圖2(a))；10 μm×10 μm的正方形，其極性方向平行與垂直概率各半，即隨機排列組，以下均簡稱為隨機組(random group,RG)(見圖2(b))；40 μm×10 μm的長方形，其極性方向垂直于整體條帶方向，即垂直排列組，以下均簡稱為垂直組(vertical group，VG)(見圖2(c))；條帶狀無極性圖案，即對照組(control group,CG)(見圖2(d))。其中，極性圖案之間的最小間隔均為5 μm。

將設計好的微圖案通過激光直寫光刻系統(tǒng)和微接觸印刷技術(shù)，各組均獲得了尺寸較為精確的光刻膠基底(見圖3(a))和PDMS印章(見圖3(b))。通過對FN蛋白微圖案基底進行免疫熒光染色，觀察到了所制備微圖案外觀為極性排列，微圖案排列均勻、清晰完整。通過Image J對FN微圖案免疫熒光染色圖(見圖3(c))進行了測量，測量參數(shù)及統(tǒng)計結(jié)果如表1所示。表1證明，制備獲得的PDMS薄膜基底FN極性微圖案尺寸與所設計的尺寸基本相符，滿足實驗需求。

圖3 微圖案基底制備熒光顯微鏡照片(每行從左到右依次為PG、RG、VG、CG)。 (a)光刻膠基底明場圖(20×)；(b)PDMS印章明場圖(40×)；(c)FN蛋白微圖案熒光染色圖(10×)Fig.3 FM photos of micropattern substrates(In each raw，the order from left to right is PG, RG, VG, CG). (a) Bright field image of micropattern on the photoresist stencil (20×); (b) PDMS stamp (40×)；(c) Immunofluorescence staining of FN micropattern on the PDMS film substrates (10×)

Tab.1ThestatisticsofdifferentFNmicropatternparametersbyfluorescencestainingn=10

2.2 FN極性對成肌細胞分化的影響

對不同極性微圖案上的細胞進行誘導分化，免疫熒光染色法觀察細胞的分化狀態(tài)(見圖4)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組長條帶微圖案上的細胞在誘導7 d后，分化形成的肌管數(shù)最多，誘導分化效果最好(見圖4(d)、圖5)。

圖4 成肌細胞極性排列誘導分化熒光染色圖。 (a)平行組(PG)；(b)隨機組(RG)；(c)垂直組(VG)；(d)對照組(CG)Fig.4 Immunofluorescence staining of C2C12 induced differentiation on different polarity arrangement FN micropattern. (a) Parallel group(PG)；(b) Random group(RG)；(c) Vertical group(VG)；(d) Control group(CG)

值得關(guān)注的是，極性排列的微圖案上的細胞誘導分化7 d后，極性方向平行于整體條帶組PG所形成的肌管數(shù)與對照組相比無顯著性差異(個數(shù)分別為17.33±0.58、16±1.73)，極性方向平行于整體條帶組PG上肌管形成個數(shù)明顯高于垂直組VG和無極性組RG(見圖5，分別為7±1、10.89±0.19)。

圖5 不同極性微圖案誘導分化肌管總數(shù)Fig.5 The myotubes numbers induced on different polarity micropattern

2.3 FN極性對成肌細胞微絲分布的影響

隨著時間推移，成肌細胞逐漸在FN極性微圖案上進行黏附和鋪展，細胞骨架肌動蛋白微絲也會隨時間出現(xiàn)規(guī)律性的變化。通過利用Matlab軟件對所得的細胞骨架圖像進行平滑處理，將細胞骨架在空間方位分布的頻率以直方圖的形式體現(xiàn)，如圖6所示。

圖6 不同時間點肌動蛋白纖維絲取向分布(每行從左到右依次為PG、RG、VG、CG)。(a) 2 h；(b) 6 h；(c) 12 hFig.6 Histogram of actin orientation angles of C2C12 cells at different time on the different FN micropattern substrate(In each raw，the order from left to right is PG, RG, VG, CG). (a) 2 h；(b) 6 h；(c) 12 h

對3個時間點(2、6、12 h)的微圖案基底上的細胞骨架進行軟件模擬分析，并對比了3個不同時間下成肌細胞在極性微圖案上的細胞骨架微絲取向分布概率之間的規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，成肌細胞在微圖案上生長2 h后，從肌動蛋白纖維絲矢量圖可以看出，不同極性排列微圖案的微絲分布差異明顯，微絲組裝與局部微圖案極性取向相同(見圖6(a))，表明細胞微絲分布方向在2 h左右受FN局部微圖案極性排列影響非常明顯。在細胞培養(yǎng)6 h后(見圖6(b))，肌動蛋白纖維絲矢量方向開始出現(xiàn)“適應性”改變，微絲分布開始逐漸沿整體條帶圖案長軸方向發(fā)生聚集；暗示細胞開始產(chǎn)生變形并逐漸開始脫離局部圖案束縛，沿整體圖案長軸方向鋪展，細胞骨架發(fā)生重排。在細胞培養(yǎng)12 h后，幾種圖案上肌動蛋白纖維絲矢量都只沿整體圖案長軸方向排列(見圖6(c))，肌動蛋白纖維絲的矢量分布已無法觀察到明顯的組間差別。推測是由于此時細胞沿條帶長軸方向鋪展，細胞之間已經(jīng)形成連接。

由此可知，微圖案整體長軸方向決定了細胞骨架最終的空間方位和肌動蛋白微絲的分布，F(xiàn)N微圖案極性排列方向，在細胞黏附早期會對細胞的微絲和骨架分布有明顯影響。

2.4 FN極性對成肌細胞黏附的影響

待18 h后，細胞完全鋪展，進一步通過對成肌細胞在不同極性FN微圖案上黏著斑的形成區(qū)域和排列方向進行分析。

圖7 C2C12細胞黏著斑免疫熒光染色圖(100×，白箭頭所指為黏著斑)。 (a)平行組；(b)隨機組；(c)垂直組；(d)對照組 Fig.7 Immunofluorescence staining of adhesion plaque in C2C12. (100×，The white arrow in all of the image showed adhesion plaque). (a) Parallel group; (b) Random group; (c) Vertical group; (d) control group

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)N微圖案極性排列會對成肌細胞黏著斑的形成產(chǎn)生影響，如圖7所示。與對照組相比，極性微圖案各組間細胞黏著會在微圖案分布區(qū)域形成，并且黏著斑的分布與局部FN微圖案排列一致，實驗結(jié)果提示FN微圖案可以控制黏著斑的分布。進一步分析黏著斑的排列方向，發(fā)現(xiàn)隨機組和對照組黏著斑的排列方向較為分散、隨機，而平行組和垂直組黏著斑的排列方向較為集中，且沿著長條帶微圖案整體方向分布。但是，與對照組相比，極性排列由于微圖案的影響，各組間形成的黏著斑均被“打斷”，無法形成連續(xù)的黏著斑。

3 討論

在許多研究中，微圖案化技術(shù)可以用來控制細胞的幾何排列，控制細胞的取向在組織及器官的構(gòu)建中具有重要意義。Toshinori等研究了在各向異性(正交)和各向同性(平行)的多層PLGA細胞培養(yǎng)板上的小鼠骨骼肌成肌細胞(C2C12)分化情況，發(fā)現(xiàn)空間的細胞取向會對細胞的分化、肌管的構(gòu)建以及基因的表達產(chǎn)生影響[18]。Takayama等證實，在線性(條帶狀)微圖案上形成的肌管表現(xiàn)出融合率增加，而線性微圖案可增強肌管對外部電刺激的響應[19]。

Liu等通過研究發(fā)現(xiàn)，在微圖案上的成肌細胞，其骨架肌動蛋白的排列方向會逐漸平行于整個圖案排列的方向，而不是單一圖案的方向[20]。這表明，細胞排列也是決定細胞生理學的一個重要因素，而這種復合微圖案可以精確地控制細胞連接、細胞相互作用、細胞信號轉(zhuǎn)導的多個細胞。Moraes等通過研究發(fā)現(xiàn)，可以通過適當設計微圖案尺寸或者改變制造工藝條件來控制細胞在微圖案上的形態(tài)，主要取決于微圖案的寬度和密度[21]。

本實驗通過設計3種類型不同長寬比(1∶4、4∶1、1∶1)極性排列線性微圖案條帶，通過與無極性排列的長條帶微圖案做比較，發(fā)現(xiàn)微圖案極性影響小鼠成肌細胞的黏附和細胞骨架微絲蛋白F-actin 的重排過程。隨時間變化，細胞黏附和鋪展狀態(tài)逐漸變好，細胞微絲蛋白會沿著整體圖案的長軸方向形成聚集。同時，有極性的微圖案對細胞的黏附會產(chǎn)生影響，無極性長條帶上的細胞生長狀態(tài)良好。這表明，通過合理控制微圖案的極性排列，可以更精確地控制細胞骨架肌動蛋白微絲的分布。

本實驗對18 h極性排列成肌細胞中的黏著斑進行染色，發(fā)現(xiàn)極性排列微圖案對黏著斑的形成也會產(chǎn)生影響，由于FN微圖案局部排列不同，其黏著斑的形成區(qū)域和排列方向也會有差別。這說明，通過設計不同排列的FN微圖案，可以更好地控制細胞的黏附和形態(tài)。

在對極性排列微圖案上進行小鼠成肌細胞誘導分化培養(yǎng)7 d后，免疫熒光染色的結(jié)果分析還表明，不同極性微圖案上對管形成的數(shù)量會有不同程度的影響：條帶微圖案對照組分化效果最好，形成的肌管數(shù)量最多；其次是微圖案極性方向平行于條帶微圖案長軸方向組，形成的肌管數(shù)量要明顯高于微圖案極性垂直于條帶微圖案長軸方向組和微圖案極性取向隨機組。分析認為，該結(jié)果可能是因為FN微圖案的極性對成肌細胞黏附有一定的影響，從而導致了細胞在分化過程中的黏附和鋪展效果的差異。這對進一步探索如何進行極性排列下的成肌細胞的分化，以及如何獲得平行排列的分化肌管，提供理論依據(jù)。

綜上所述，對細胞外基質(zhì)蛋白FN的不同極性排列模式下成肌細胞分化的研究結(jié)果表明，微圖案極性對小鼠成肌細胞分化過程會產(chǎn)生影響，主要體現(xiàn)在不同極性FN微圖案上誘導分化7 d后，形成的肌管數(shù)目有顯著性差異。進一步的研究表明，不同極性FN微圖案上成肌細胞的骨架與黏著斑的分布和排列不同。微圖案極性排列對小鼠成肌細胞黏附早期的骨架分布會有顯著的影響，而在細胞黏附的中后期開始逐漸減弱，其微絲骨架會逐漸沿整體圖案長軸方向產(chǎn)生聚集和重排，并且可以通過FN微圖案控制成肌細胞黏著斑的形成區(qū)域和排列方向。

4 結(jié)論

當FN微圖案極性方向平行于條帶微圖案長軸方向時，最有利于成肌細胞融合形成極性排列的肌管，這對于在二維水平上更好地控制成肌細胞的分化提供了理論指導。在不同極性微圖案上，成肌細胞誘導分化形成肌管的能力不相同，其原因可能是由不同極性圖案上細胞的黏附和鋪展不同而引起。分子水平和蛋白水平的差異還有待于進一步研究。