王香青 馬振軍 孔方方

中國(guó)人民解放軍464醫(yī)院婦產(chǎn)科，天津 300381

妊娠糖尿病在全球范圍內(nèi)影響著近15%的孕婦，其發(fā)病率隨著肥胖與2型糖尿病發(fā)生幾率的增加而提高[1]。根據(jù)國(guó)際糖尿病與妊娠研究組標(biāo)準(zhǔn)，全球范圍內(nèi)妊娠糖尿病的發(fā)病率接近18%[2]。盡管妊娠糖尿病患者的葡萄糖耐量在產(chǎn)后可以恢復(fù)正常，但是妊娠糖尿病極大增加了其將來(lái)發(fā)生糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，妊娠糖尿病母親所生女?huà)雽?lái)更容易發(fā)生妊娠糖尿病[3]。因此，了解妊娠糖尿病發(fā)生的病理生理學(xué)機(jī)制，選擇合適的治療方案，以獲得良好的妊娠結(jié)局非常重要。外泌體是納米大小的顆粒，直徑為50～120 nm，參與細(xì)胞間的信息傳遞，包括生物活性分子如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、RNA的轉(zhuǎn)運(yùn)[4-7]。研究顯示，外泌體通過(guò)激活自身免疫、增加β細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子等，參與糖尿病的發(fā)生[8]。而最新的研究發(fā)現(xiàn)，妊娠時(shí)血漿外泌體水平顯著升高，胎盤(pán)細(xì)胞來(lái)源的外泌體在調(diào)節(jié)母體和(或)胎兒血管的反應(yīng)中發(fā)揮作用，外泌體水平的改變可能用于診斷胎盤(pán)的功能異常[9]。另外，妊娠糖尿病患者血漿外泌體水平也顯著升高[10]。因此，外泌體可能也參與了妊娠糖尿病的病理生理學(xué)機(jī)制。

1 外泌體概述

細(xì)胞外囊泡是膜來(lái)源的顆粒，在細(xì)胞間信息傳遞中發(fā)揮關(guān)鍵作用，負(fù)責(zé)從近端向遠(yuǎn)端傳遞分子信號(hào)[11]。細(xì)胞外囊泡是由一系列不同的顆粒組成，根據(jù)來(lái)源、形態(tài)及釋放到細(xì)胞外的模式，主要分為3個(gè)顆粒群，即凋亡體、微粒體及外泌體。凋亡體的直徑為0.8～5 μm，參與細(xì)胞的程序性死亡。微粒體又稱(chēng)為核外顆粒體，直徑為0.1～0.35 μm，來(lái)源于血漿質(zhì)膜外出芽[12]。外泌體是被稱(chēng)為多泡小體的特定內(nèi)涵體與質(zhì)膜融合后分泌到細(xì)胞外環(huán)境的囊泡，在許多生物學(xué)過(guò)程中介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間的信息交流[13]。

外泌體就像細(xì)胞的指紋，能夠反映其來(lái)源細(xì)胞的表型。它們的關(guān)鍵作用是協(xié)調(diào)與調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的分子信號(hào)通路，在疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。人體所有細(xì)胞包括脂肪組織、肝臟、胰腺、骨骼肌及妊娠時(shí)期的胎盤(pán)，都可以分泌外泌體。與正常飲食喂養(yǎng)的小鼠相比，富含棕櫚油飲食喂養(yǎng)的小鼠骨骼肌細(xì)胞分泌更多的外泌體，用富含棕櫚油的脂肪酸預(yù)處理C2C12肌細(xì)胞，也可以促進(jìn)C2C12肌細(xì)胞分泌外泌體。將從脂肪酸預(yù)處理的C2C12肌細(xì)胞分離得到的外泌體與分化的C2C12肌細(xì)胞共孵育，可以誘導(dǎo)肌細(xì)胞內(nèi)某些基因與蛋白表達(dá)的改變，表明外泌體可以將脂肪酸的作用傳遞給肌細(xì)胞，從而破壞肌細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，參與脂質(zhì)誘導(dǎo)的胰島素抵抗的發(fā)生[14]。對(duì)胰腺癌來(lái)源的外泌體進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其可進(jìn)入C2C12骨骼肌細(xì)胞，促進(jìn)脂質(zhì)沉積，抑制葡萄糖攝入。同時(shí)，外泌體可以下調(diào)胰島素及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B/FoxO1信號(hào)通路，降低下游葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4的活性[15]。從高脂飲食喂養(yǎng)小鼠骨骼肌細(xì)胞分離得到的外泌體可以被MIN6B1細(xì)胞攝取。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，外泌體攜帶的微小RNA(miRNA)-16可以改變MIN6B1細(xì)胞的mRNA及基因的表達(dá)，誘導(dǎo)MIN6B1細(xì)胞增殖。表明骨骼肌來(lái)源的外泌體可以將脂肪酸作用傳遞下去，促進(jìn)其他細(xì)胞胰島素抵抗的發(fā)生[16]。

同樣的，高脂飲食喂養(yǎng)B6小鼠脂肪組織來(lái)源的外泌體可以被外周血單核細(xì)胞攝取，并分化為巨噬細(xì)胞，同時(shí)，其分泌的腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6增加。而將該外泌體注射到野生型C57BL/6小鼠體內(nèi)，可引起其發(fā)生胰島素抵抗。表明脂肪組織來(lái)源的外泌體作為脂肪組織與巨噬細(xì)胞相互作用的橋梁，介導(dǎo)了代謝性疾病的發(fā)生[17]。

2 妊娠糖尿病時(shí)外泌體水平的變化及機(jī)制

2.1 妊娠糖尿病時(shí)血漿外泌體水平升高 正常妊娠期間，機(jī)體會(huì)發(fā)生一些代謝變化，妊娠早期脂肪沉積增加，妊娠晚期可發(fā)生胰島素抵抗及脂解作用增加，胎盤(pán)在介導(dǎo)母體生理改變與胎兒發(fā)育中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。孕期前3個(gè)月時(shí)，細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞、滋養(yǎng)層細(xì)胞、絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞、胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞在細(xì)胞外環(huán)境改變(如氧濃度發(fā)生變化)時(shí)可以釋放外泌體[18]。細(xì)胞外囊泡特別是外泌體里包裹著許多的蛋白、miRNA及磷脂，在維持胎兒與母體間信息傳遞中發(fā)揮重要作用。在一項(xiàng)縱向研究中發(fā)現(xiàn)，妊娠期間血漿胎盤(pán)來(lái)源的攜帶人胎盤(pán)堿性磷酸酶(PLAP)的外泌體濃度增加，且與平均子宮動(dòng)脈血流有關(guān)。與未妊娠女性相比，妊娠女性血漿外泌體濃度增加50倍，并且在整個(gè)妊娠期間，外泌體的濃度都是增加的[9]。其中從妊娠6周開(kāi)始，母體血漿中即可檢測(cè)到外泌體，在妊娠6～12周時(shí)增加。同時(shí)，在病理生理狀態(tài)下，如先兆子癇、妊娠糖尿病，外泌體濃度會(huì)有很大變化[19]。研究顯示，與正常妊娠女性相比，妊娠糖尿病患者外泌體水平顯著升高。與妊娠時(shí)血糖水平正常女性相比，妊娠糖尿病患者在妊娠11～14周時(shí)，母體血漿總的外泌體水平升高2倍。與正常妊娠女性相比，妊娠糖尿病患者在孕早期PLAP+外泌體濃度約增加1.6倍，孕中期時(shí)約增加1.5倍，孕晚期時(shí)約增加1.3倍[20]。

2.2 妊娠時(shí)外泌體水平升高的機(jī)制

2.2.1 高糖 外泌體的生物合成與釋放受葡萄糖濃度影響。Rice等[18]將孕期前3個(gè)月滋養(yǎng)層細(xì)胞在D-葡萄糖(5 mmol/L或25 mmol/L)及1%、3%、8% O2的條件下培養(yǎng)48 h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，在不同氧濃度條件下，高糖(25 mmol/L)都可以促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞釋放外泌體(P<0.001)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，妊娠糖尿病患者胎盤(pán)來(lái)源的外泌體可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放IL-8、TNF-α。高糖可以增加內(nèi)皮細(xì)胞分泌外泌體的數(shù)量，改變外泌體蛋白及RNA的成分，但并沒(méi)有改變外泌體的大小。

Sáez等[10]從低糖(5 mmol/L)、高糖(25 mmol/L)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)分離得到外泌體，再分別與高糖或低糖濃度培養(yǎng)的HUVEC共孵育，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖可以增加HUVEC釋放外泌體數(shù)量，促進(jìn)內(nèi)皮損傷修復(fù)及增加磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、人陽(yáng)離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1(hCAT-1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及細(xì)胞間黏附分子-1的表達(dá)。高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的HUVEC提取的外泌體也可以增加低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的HUVEC損傷修復(fù)及磷酸化eNOS、hCAT-1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，而低糖培養(yǎng)基中HUVEC提取的外泌體能夠逆轉(zhuǎn)高糖對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷修復(fù)的影響，使hCAT-1 mRNA的表達(dá)恢復(fù)至正常水平。

2.2.2 低氧 妊娠糖尿病時(shí)血糖升高及低氧都可以改變外泌體的水平及生物活性。低氧誘導(dǎo)因子-1是外泌體生物合成的重要條件因子，多種病理生理狀態(tài)下檢測(cè)到低氧誘導(dǎo)因子-1介導(dǎo)的細(xì)胞間外泌體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。內(nèi)皮細(xì)胞遷移及血管新生增加是細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，外泌體參與介導(dǎo)了這些血管改變。妊娠期間，低氧可以觸發(fā)外泌體信號(hào)，增加胎盤(pán)血管新生，增強(qiáng)細(xì)胞滋養(yǎng)層侵襲和增殖，以保護(hù)胎兒免受氧化應(yīng)激損傷[21]。研究發(fā)現(xiàn)，使用不同氧濃度(1%、3%、8%)培養(yǎng)細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)低氧(1%)可促進(jìn)外泌體的產(chǎn)生以及細(xì)胞侵襲與增殖[22]。

2.2.3 肥胖 妊娠時(shí)，為了維持對(duì)胎兒的營(yíng)養(yǎng)供給，母體的脂肪量增加。但是脂肪組織增生肥大與代謝異常及胰島素抵抗密切相關(guān)[23]。研究顯示，外泌體的釋放依賴(lài)于體重。肥胖者與瘦者脂肪組織外泌體的濃度不同[24]。與瘦的動(dòng)物相比，肥胖動(dòng)物脂肪細(xì)胞分泌更多的外泌體，進(jìn)一步研究顯示，這些外泌體是由瘦的脂肪組織分泌的。分析其原因可能是瘦的脂肪組織中的脂肪細(xì)胞數(shù)量更高，從而導(dǎo)致外泌體的數(shù)量增加[25]。

母親高的體重指數(shù)與總的外泌體濃度增加有關(guān)，同時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞IL-6、8及TNF-α的釋放增加，表明外泌體在妊娠期間可以調(diào)節(jié)母體的系統(tǒng)性炎性反應(yīng)。母體血漿外泌體水平與母親的體重指數(shù)密切相關(guān)，體重指數(shù)很高的患者，PLAP+外泌體與總外泌體的比值較低[26]。有學(xué)者證實(shí)，妊娠糖尿病時(shí)，外泌體數(shù)量的增加是由于總的外泌體增加而不是PLAP+外泌體數(shù)量增加[20]。然而，這些額外的循環(huán)外泌體的出現(xiàn)在肥胖與妊娠糖尿病發(fā)生中的作用尚不明確，還需進(jìn)一步研究。

3 異常表達(dá)的外泌體對(duì)妊娠糖尿病的影響機(jī)制

3.1 外泌體與L-精氨酸/一氧化氮信號(hào)通路 內(nèi)皮細(xì)胞外泌體可以調(diào)節(jié)PI3K/eNOS信號(hào)通路，在妊娠糖尿病患者胎兒胎盤(pán)的內(nèi)皮功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。外泌體攜帶miRNA-203，后者可以誘導(dǎo)eNOS活性，因此推測(cè)妊娠糖尿病患者胎兒血循環(huán)外泌體中可能也攜帶miRNA-203，從而影響胎兒內(nèi)皮細(xì)胞的功能[27]。還有研究顯示，合體滋養(yǎng)層細(xì)胞來(lái)源的外泌體內(nèi)含有eNOS，可以調(diào)節(jié)一氧化氮的產(chǎn)生[28]。從妊娠糖尿病患者臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分離獲得的外泌體，通過(guò)hCAT-1可以增加L-精氨酸的運(yùn)輸[29]。上述研究表明，妊娠糖尿病患者外泌體在胎兒循環(huán)中可能發(fā)揮潛在的作用，誘導(dǎo)胎兒胎盤(pán)內(nèi)皮功能異常。

3.2 外泌體與內(nèi)皮激活 外泌體與內(nèi)皮細(xì)胞在體外共培養(yǎng)，可以上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。對(duì)HUVEC的研究發(fā)現(xiàn)，與來(lái)自正常妊娠女性體內(nèi)的外泌體共培養(yǎng)，使其粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、IL-4、IL-6、IL-8、干擾素-γ、 TNF-α的釋放增加約1.8倍，而與來(lái)自妊娠糖尿病患者體內(nèi)的外泌體共培養(yǎng)，細(xì)胞因子的釋放增加約3倍[19]。母體循環(huán)來(lái)源的外泌體可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移。與未妊娠女性相比，從妊娠女性體內(nèi)分離的外泌體促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的作用更強(qiáng)(P<0.05)。

從未良好控制血糖的糖尿病患者多種不同類(lèi)型的細(xì)胞中分離得到的外泌體都包含有TNF-α。TNF-α是重要的炎性因子，外泌體通過(guò)它在炎性反應(yīng)及內(nèi)皮細(xì)胞功能中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[30]。將HUVEC與單核細(xì)胞來(lái)源的外泌體共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮的促凝性、細(xì)胞凋亡及血管新生增加，表明單核細(xì)胞來(lái)源的外泌體也參與了內(nèi)皮功能紊亂的發(fā)生[31]。

3.3 外泌體與氧化應(yīng)激 多項(xiàng)研究顯示，外泌體可以影響氧化應(yīng)激。其可誘導(dǎo)微血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生活性氧簇，增加NAPDH氧化酶的活性[32]。將正常孕婦臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與來(lái)自妊娠糖尿病患者臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的外泌體共孵育，可以誘導(dǎo)eNOS活性及一氧化氮合成增加[29]。同樣，來(lái)自正常孕婦臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的外泌體可以使高糖誘導(dǎo)這些細(xì)胞發(fā)生的功能異常得到逆轉(zhuǎn)[10]。

3.4 通過(guò)miRNA調(diào)節(jié)基因表達(dá) 外泌體中的核酸種類(lèi)非常豐富，包含DNA、mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA等，在細(xì)胞間的遺傳物質(zhì)信息傳遞過(guò)程中發(fā)揮重要作用。外泌體miRNA的傳遞可干預(yù)靶細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)mRNA的轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)的生成，誘導(dǎo)靶細(xì)胞短暫或持續(xù)性的表型變化，參與調(diào)節(jié)多種生理和病理過(guò)程。越來(lái)越多的研究關(guān)注外泌體中胎盤(pán)特異性miRNA即染色體19miRNA簇(C19MC)，它由58個(gè)miRNA組成，定位于染色體19q13.41，特異性表達(dá)于人類(lèi)胎盤(pán)及未分化的細(xì)胞[33]。研究發(fā)現(xiàn)，與正常妊娠女性相比，妊娠糖尿病患者胎盤(pán)來(lái)源的外泌體特異性C19MC miRNA，包括miRNA-518a-5p、miRNA-518b、miRNA-518c、miRNA-518e、miRNA-520c-3p、miRNA-525-5p表達(dá)增加，與病理性妊娠(如妊娠糖尿病)密切相關(guān)[34]。外泌體內(nèi)滋養(yǎng)層細(xì)胞特異性分泌的C19MC miRNAs在胎盤(pán)與母體信息交流中發(fā)揮重要作用，可能參與母體對(duì)妊娠過(guò)程的適應(yīng)。

綜上所述，妊娠糖尿病時(shí)由于高糖、低氧、母體體重增加導(dǎo)致外泌體水平升高，其可能作為一種生物標(biāo)志物，用于妊娠糖尿病的診斷。同時(shí)，升高的外泌體還可通過(guò)誘導(dǎo)一氧化氮合成、氧化應(yīng)激、內(nèi)皮功能紊亂，以及通過(guò)釋放miRNA調(diào)節(jié)基因表達(dá)，進(jìn)一步影響妊娠糖尿病的進(jìn)展。外泌體在妊娠糖尿病發(fā)生中的作用是因還是果，仍需深入研究。