馬 亮，于 洋，張婧瑩，叢 笑，劉 倩，楊 輝，曹永彤

(中日友好醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100029)

乙型肝炎病毒(HBV)是一種經(jīng)血液傳播的嗜肝DNA病毒，是導(dǎo)致慢性肝炎、肝癌和肝硬化的重要因素。慢性乙型肝炎病毒(CHB)在我國(guó)是一種傳播范圍廣、感染人數(shù)眾多的傳染性疾病，我國(guó)HBV慢性感染者約為9 000萬(wàn)，居世界之首，每年約100萬(wàn)人死于HBV感染所致的肝硬化、肝衰竭及原發(fā)性肝癌[1-2]，CHB的監(jiān)控和治療一直以來(lái)都是傳染病防治的重中之重。目前核苷酸類似物治療CHB患者的療效已得到肯定，但因其對(duì)HBV cccDNA無(wú)直接作用，患者需長(zhǎng)期服用，在治療過(guò)程中很容易引起HBV耐藥突變[2]。長(zhǎng)期使用單種核苷酸類藥物，患者很容易發(fā)生針對(duì)此藥物的耐藥突變。同時(shí)，由于單種核苷酸藥物耐藥突變位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)藥物的多重性，患者很可能產(chǎn)生新的耐藥或交叉耐藥，為臨床治療帶來(lái)困難[3]。使用體外檢測(cè)手段，對(duì)CHB患者進(jìn)行基因耐藥突變檢測(cè)，可以準(zhǔn)確有效地對(duì)其突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，以判斷該患者對(duì)已知藥物的耐受程度，進(jìn)而更好地指導(dǎo)臨床用藥，制定個(gè)體化抗病毒治療方案。目前，已有多種分子診斷技術(shù)平臺(tái)可以檢測(cè)乙型肝炎耐藥基因突變[4]，Sanger測(cè)序法作為測(cè)序檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，是目前最為準(zhǔn)確、有效的檢測(cè)手段。本實(shí)驗(yàn)使用Sanger測(cè)序法對(duì)CHB患者血清核酸PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)HBV耐藥相關(guān)位點(diǎn)突變及HBV病毒基因型，統(tǒng)計(jì)目前常用藥物對(duì)應(yīng)位點(diǎn)發(fā)生突變的情況，為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1病例標(biāo)本 收集2016年10月至2018年6月中日友好醫(yī)院CHB患者血清共215例，其中男42例，女73例，年齡19～84歲，中位年齡39歲。所有患者均符合乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS299-2008)，HBV-DNA 大于1×103U/mL，患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2主要試劑和儀器 HBV-DNA提取試劑盒，購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；HBV-DNA純化試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；HBV-DNA測(cè)序試劑盒購(gòu)自廣州立菲達(dá)安診斷產(chǎn)品技術(shù)有限公司；C-1000 TOUCH PCR儀購(gòu)自美國(guó)BioRad公司；3500Dx測(cè)序儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 采集患者空腹不抗凝靜脈血5 mL,2 500 r/min離心10 min,分離血清。

1.3.2HBV-DNA提取 使用生工生物工程(上海)股份有限公司DNA提取試劑盒，按照試劑說(shuō)明書(shū)提取HBV-DNA。

1.3.3HBV-DNA擴(kuò)增 50 ℃ 2 min，95 ℃共15 min預(yù)變性，94 ℃ 30 s→55 ℃ 30 s→72 ℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)，72 ℃ 7 min。

1.3.4HBV-DNA純化 使用生工生物工程(上海)股份有限公司提取試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)所列步驟進(jìn)行純化。

1.3.5測(cè)序PCR 體系配置 PCR產(chǎn)物 0.5 μL，BigDye 2 μL，BigDye Buffer 3 μL，測(cè)序引物1 μL，無(wú)菌純化水13.5 μL，總體積20 μL。擴(kuò)增程度為96 ℃ 1 min，然后96 ℃ 10 s→50 ℃ 5 s→60 ℃ 4 min共25個(gè)循環(huán)，最后4 ℃保溫。

1.3.6測(cè)序產(chǎn)物純化 各PCR反應(yīng)管加入2 μL 125 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)和2 μL 3 mol/L醋酸鈉(pH 5.2)，再加入50 μL 100%無(wú)水乙醇，短時(shí)振蕩，室溫避光放置15 min；4 ℃ 12 000 r/min離心30 min，去上清，加入150 μL預(yù)冷70%乙醇，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，去上清，室溫避光放置15～30 min；加入10 μL Hi-Di Formamide，短時(shí)振蕩溶解DNA，短時(shí)離心，95 ℃變性5 min，冰中冷卻4 min。

1.3.7電泳 使用1%瓊脂糖電泳，觀察PCR產(chǎn)物存在及純化情況。

1.3.8測(cè)序 變性后的測(cè)序產(chǎn)物加入與基因分析儀配套的96孔板，選用具有IVD標(biāo)志的Seq_std_BDTV3.1_ASSY_POP7 進(jìn)行測(cè)序。

1.4數(shù)據(jù)收集與分析 使用ABI公司Data Collection?與Sequencing Analysis軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)收集和初步分析，使用STANDFORD軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行深度分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1在本研究215例患者中，共有40例(18.6%，40/215)患者檢測(cè)到發(fā)生耐藥基因突變，其中具有對(duì)應(yīng)參考價(jià)值的為21例(9.77%，21/215)。該215例患者中相關(guān)藥物耐藥突變率從高至低依次是拉米夫定(LAM,9.77%,21/215)、恩曲他濱(FTC,7.44%,16/215)，恩替卡韋(ETV,6.98%,15/215)，替比夫定(LdT,6.05%,13/215)，阿德福韋(ADV,0.93%,2/215)；未檢出與替諾福韋(TDF)耐藥相關(guān)突變。常見(jiàn)CHB治療用藥與相關(guān)耐藥突變位點(diǎn)，TDF為A194T；LdT為M204I；ADV為A181V/T、N236T；LAM/LMV為M204I/V、A181T/V、L180M、V173L；FTC為M204I、L180M、V173L；ETV為M204I、L180M。見(jiàn)表1。其余19例雖然檢測(cè)到突變位點(diǎn)，但所發(fā)生突變的位點(diǎn)并不與耐藥明確相關(guān)，以備注中與耐藥明確相關(guān)的6個(gè)位點(diǎn)作為參考標(biāo)準(zhǔn)。

2.2耐藥連鎖位點(diǎn)突變情況 在檢測(cè)到的21例耐藥突變患者中，發(fā)生耐藥連鎖位點(diǎn)突變的共11例，占52.38%(11/21)，其余為47.62%為單一位點(diǎn)突變。最主要的連鎖模式為M204I+L180M，共7例；剩下兩種連鎖模式A181V+N236T和M204V+L180M各2例。

2.3不同基因型耐藥基因發(fā)生情況 本研究215例患者中B基因型占所有患者的29.77%(64/215),耐藥發(fā)生比例為6.25%(4/64)；C基因型占所有患者的68.84%(148/215),耐藥發(fā)生比例為11.49%(17/148)；D基因型占所有患者的1.40%(3/215)，耐藥發(fā)生比例為0。本研究中C基因型明顯高于B基因型(P<0.01),C基因型與B基因型基因突變情況差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

注：-表示無(wú)數(shù)據(jù)

3 討 論

乙型肝炎治療的總體目標(biāo)是最大限度地長(zhǎng)期抑制或消除HBV,減輕肝細(xì)胞壞死及肝纖維化，延緩或阻止疾病進(jìn)展，減少或防止肝硬化，肝癌及其并發(fā)癥的發(fā)生。核苷類藥物抗病毒治療能很好控制疾病進(jìn)展，長(zhǎng)期治療能使患者肝組織得到改善[5]。但是，長(zhǎng)期應(yīng)用核苷類藥物會(huì)使HBV在藥物選擇壓力和免疫壓力下發(fā)生突變，產(chǎn)生耐藥基因甚至臨床耐藥突變[6]。耐藥的發(fā)生極大地降低了CHB患者的治療效果。因此在治療過(guò)程中動(dòng)態(tài)地進(jìn)行耐藥監(jiān)測(cè)對(duì)CHB的治療和預(yù)后具有重要的意義。

而LAM目前仍是我國(guó)臨床進(jìn)行抗HBV治療的主要藥物，本研究中215例患者中21例患者發(fā)生LAM耐藥突變，突變比例為9.77%(21/215)。在21例患者中，18例檢測(cè)到M204I/V位點(diǎn)突變，其中9例伴隨L180M位點(diǎn)突變；1例為V173L位點(diǎn)突變；2例為A181V突變。這類突變發(fā)生的比例較高，提示了LAM易產(chǎn)生耐藥性。本研究結(jié)果與王清等[7]研究結(jié)果較一致。本研究中其他耐藥突變檢出率從高到低依次為FTC(16/215,7.44%)，ETV(15/215,6.98%)，LdT(13/215,6.05%)，ADV(2/215,0.93%)；未檢出與TDF耐藥相關(guān)突變。所以從本研究結(jié)果可以看出FTC、ETV和LdT 3種藥物耐藥發(fā)生率也比較高。患者發(fā)生TDF耐藥突變?cè)谂R床上確實(shí)很少出現(xiàn)，這也指示了TDF在乙型肝炎治療廣闊的應(yīng)用前景。

HBV耐藥突變位點(diǎn)連鎖分析是指研究多個(gè)耐藥突變位點(diǎn)是發(fā)生于同一個(gè)病毒株上還是位于不同病毒株上以及耐藥位點(diǎn)的組合方式。多數(shù)情況下對(duì)同一藥物的耐藥是由多個(gè)耐藥突變位點(diǎn)的存在所造成，并且多個(gè)耐藥突變位點(diǎn)的組合情況對(duì)抗病毒藥物是否產(chǎn)生耐藥以及耐藥的程度存在很大的不同[8]。LAM主要的耐藥突變位點(diǎn)M204V/I較野生復(fù)制能力低，而L180M、V173L的出現(xiàn)使突變株HBV的復(fù)制能力接近野生株的水平[9]，因此，對(duì)HBV耐藥突變位點(diǎn)進(jìn)行連鎖分析對(duì)于臨床抗病毒治療方案的選擇以及流行病學(xué)的研究意義重大。本研究中主要的連鎖模式也是M204I+L180M，與既往研究結(jié)果類似[10-11]。

HBV病毒可分為A～I(xiàn) 19種基因型，HBV基因型具有一定的地域性差異，我國(guó)南方以B型為主，北方以C型為主，D型主要見(jiàn)于西藏和部分少數(shù)民族地區(qū)。本研究中C基因型明顯高于B基因型(P<0.01),支持HBV基因型具有地域性差異這一結(jié)論。并且本研究中也檢測(cè)到少量D基因型1.40%(3/215)，這可能與北京人口流動(dòng)較大有關(guān)。

關(guān)于HBV基因型與核苷類耐藥的相關(guān)性分析，結(jié)論各有差異，有研究認(rèn)為二者具有相關(guān)性[12]；另一項(xiàng)薈萃分析則表明二者之間沒(méi)有顯著相關(guān)性[13]。本研究中C基因型耐藥基因發(fā)生頻率高于B基因型，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié) 論

本研究采用一代測(cè)序方法對(duì)乙型肝炎耐藥基因突變進(jìn)行了初步分析，可以看到乙型肝炎耐藥在乙型肝炎患者人群中發(fā)生的情況，對(duì)乙型肝炎患者臨床用藥具有一定指導(dǎo)作用，也提示了臨床進(jìn)行乙型肝炎耐藥檢測(cè)的必要性。