米雪 韓萍 曹燕花 丁霄

[摘要]目的 研究壬基酚（NP）灌胃染毒對昆明種小鼠卵巢及雌激素（E2）、孕激素（P）水平等的影響，以期評價壬基酚的生殖毒性和發(fā)育毒性。方法 將30只健康的清潔（SPF）級雌性昆明小鼠隨機分為對照組（玉米油）和25、100 mg/kg NP組，每組10只。采用灌胃方式染毒，染毒容量為0.1 ml/10 g，每天1次，每周染毒5 d，連續(xù)染毒12周。測定各組小鼠血清中的E2、P、FSH并觀察卵巢組織病理切片的變化。結(jié)果 25 mg/kg NP組與對照組小鼠血清中的E2、P、FSH比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），卵巢組織病理切片中初級卵泡和成熟卵泡數(shù)目比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。100 mg/kg NP組與對照組、25 mg/kg NP組小鼠血清中的E2、P、FSH水平以及卵巢組織病理切片中初級卵泡和成熟卵泡數(shù)目比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），初級卵泡發(fā)生萎縮，卵巢顆粒細胞松散，卵母細胞核固縮，卵泡腔變小。結(jié)論 NP染毒劑量增大可對小鼠的卵巢功能造成損害，有生殖毒性和發(fā)育毒性。

[關(guān)鍵詞]壬基酚;卵巢;雌激素;促性腺激素

[中圖分類號] R71? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）1（c）-0004-04

壬基酚（nonylphenol，NP）是環(huán)境雌激素的一種，在日常生活中隨處可見，如洗滌劑、柔順劑、滑油添加劑、食用塑料產(chǎn)品以及工業(yè)橡膠制品，其廣泛地存在于生態(tài)環(huán)境中，可以通過皮膚暴露和食物以及污水進入人體，并且有蓄積性[1]和持久性，對人體的內(nèi)分泌系統(tǒng)可造成危害，影響人類健康。人類精子質(zhì)量和數(shù)量下降、男性生殖系統(tǒng)發(fā)育異?？紤]可能與有雌激素活性的外來化合物有關(guān)[2-4]。研究表明，NP[5]、雙酚 A等雌激素樣物質(zhì)在離體實驗條件下能明顯促進前列腺癌細胞 PC-3 增殖，推測與男性生殖系統(tǒng)發(fā)育異常、生殖障礙有密切關(guān)系。全世界的學(xué)者對NP造成的危害越來越重視，已有學(xué)者做過卵巢損傷后儲備功能減退的相關(guān)研究，外界環(huán)境因素能使機體免疫反應(yīng)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致成熟性卵泡的缺失[6]。郭金蓮等[7]發(fā)現(xiàn)NP劑量達到100 mg/kg可對大鼠的生殖功能產(chǎn)生抑制，改變激素水平及卵泡數(shù)目。實驗表明NP還可以對雌性大鼠的免疫[8]功能以及雄性大鼠的生殖[9]功能產(chǎn)生損傷，促進癌細胞的增殖[10]。還有證據(jù)表明，高劑量的NP可抑制睪酮[11]的分泌。

目前國內(nèi)外對NP對小鼠卵巢功能氧化損傷的研究較少，故進行本研究。

1材料與方法

1.1主要儀器與試劑

KDC-1044 型低速離心機;電子天平;光學(xué)顯微鏡。NP原液（購買于常州染料化工廠，純度>95%），超純水，魯花牌玉米油，雌激素（E2）、孕激素（P）、促性腺激素（FSH）ELISA試劑盒均購于南京建成生物公司。NP染毒溶液的配制：精準稱取適量的NP溶于玉米油中，配制成濃度分別為2.5、10 mg/ml的NP溶液。

1.2 實驗的動物的分組及染毒方法

選擇30只健康清潔（SPF）級昆明種雌性小鼠，體重18～22 g，年齡6～8周，動物合格證號：SCXK（京）2014-0004，由華北理工大學(xué)動物實驗中心提供。室溫22～24℃，濕度合適，通風(fēng)系統(tǒng)正常的無菌環(huán)境中，喂養(yǎng)標準顆粒型飼料。實驗期間小鼠自由攝食飲水。

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將30只小鼠隨機分為三組[11]，分別為對照組（玉米油），25 mg/kg、100 mg/kg NP組，每組10只。灌胃染毒[12-13]，染毒容量為0.1 ml/10 g，每天1次，每周5 d，連續(xù)染毒12周。每日觀察小鼠的一般精神狀態(tài)、活動、進食飲水量等情況，記錄小鼠的體重。

1.3小鼠卵巢重量及其臟器系數(shù)的測定

末次染毒結(jié)束24 h后，稱重并摘眼球取血，迅速分離雙側(cè)卵巢及子宮進行稱重，并計算卵巢系數(shù)（卵巢系數(shù)=卵巢重量/體重×100%）;除部分卵巢組織送病理形態(tài)學(xué)檢測外，均凍存于-80℃，備用。

1.4小鼠血清E2、P、FSH水平的的測定

末次染毒結(jié)束24 h后，摘眼球取血后，靜置10 min，離心（2000 r/min）×10 min，取上清液，檢測E2、P、FSH，具體操作步驟嚴格按照南京建成生物公司所購買的試劑盒說明書進行。

1.5小鼠卵巢組織病理學(xué)觀察

每組選取2只小鼠卵巢，常規(guī)固定、脫水、浸透、包埋，制成5 μm厚的切片，乙醇梯度脫水，常規(guī)HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠卵巢組織病理形態(tài)并攝片，鏡下每張切片隨機選取3個視野，計數(shù)總卵泡數(shù)、初級卵泡數(shù)及成熟卵泡數(shù)和閉鎖卵泡數(shù)目。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Excel 2003建立數(shù)據(jù)庫，使用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以均數(shù)±標準差表示，多組之間比較采用方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1一般情況觀察

染毒期間對照組的小鼠精神狀態(tài)良好，皮毛光澤度，活動度，糞便、進食飲水量均正常。25 mg/kg NP組大鼠的精神狀態(tài)一般，皮毛光澤度較差，活動稍減少，糞便、進食飲水量相對正常。100 mg/kg NP組大鼠的精神狀態(tài)委靡，皮毛光澤度下降，活動明顯減少，進食及飲水量減少。

2.2體重變化

染毒第6、12周，25 mg/kg NP組與對照組組間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），100 mg/kg NP組與對照組、25 mg/kg NP組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

2.3三組小鼠卵巢濕重及卵巢系數(shù)的比較

25 mg/kg NP組小鼠的卵巢濕重及卵巢系數(shù)與對照組組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），100 mg/kg NP組小鼠的卵巢濕重及卵巢系數(shù)與對照組、25 mg/kg NP組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

2.4三組小鼠血清中E2、P、FSH水平的比較

100 mg/kg NP組小鼠血清中E2、P、FSH水平明顯低于對照組、25 mg/kg NP組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;25 mg/kg NP組小鼠血清中E2、P、FSH水平低于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表3）。

2.5三組卵巢組織卵泡數(shù)目和卵巢病理形態(tài)學(xué)結(jié)果的比較

25、100 mg/kg NP組小鼠卵巢組織總卵泡、初級卵泡、成熟卵泡數(shù)目分別與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表4）。

100 mg/kg NP組小鼠卵巢HE染色，40倍鏡下與對照組比較，原始卵泡及生長卵泡的數(shù)目減少，閉鎖卵泡數(shù)目增多，200倍鏡下可見初級卵母細胞明顯萎縮，卵巢顆粒細胞松散，卵母細胞核固縮，卵泡腔變?。▓D1～4，見封四）。25 mg/kg NP組小鼠卵巢HE染色，200倍鏡下與對照組比較可見少數(shù)初級卵母細胞，卵巢顆粒細胞松散，卵母細胞核固縮（圖5，見封四）。

3 討論

NP主要經(jīng)皮膚及污水進入人體，影響人類的內(nèi)分泌系統(tǒng)，證據(jù)表明，圍生期暴露雌激素干擾物可導(dǎo)致出生缺陷及發(fā)育異常[14]。一方面兒童性早熟[15]與NP密不可分。隨著工業(yè)發(fā)展，人們更多地暴露于NP。葉麗杰等[16]的動物實驗結(jié)果有證據(jù)證明NP經(jīng)口持續(xù)染毒，當(dāng)劑量達到60 mg/kg時，雄性小鼠的精子數(shù)量減少，活精率下降，畸形率增高。本研究采用昆明種雌性小鼠經(jīng)口染毒的實驗方法，各染毒組小鼠的體重、卵巢濕重以及卵巢系數(shù)無顯著差異，可能與小鼠種類、特定的生長發(fā)育周期、染毒時間及濃度等不同有關(guān)，尚不能證明兩者之間無明顯關(guān)聯(lián)。各組小鼠卵巢的各級卵泡與對照組比較，均有所減少（P<0.05）。高劑量NP作用下小鼠卵巢的閉鎖卵泡明顯增多，血清中P、FSH較對照組明顯降低（P<0.05）;卵泡閉鎖數(shù)目增多的機制尚未明確，有人考慮與卵泡微環(huán)境內(nèi)的激素下降，營養(yǎng)支持作用不足有關(guān)，同時伴隨卵母細胞凋亡和顆粒細胞排列松散，順序紊亂等[7]。低劑量NP作用下激素水平與對照組比較未見明顯變化（P>0.05），考慮NP有劑量蓄積作用，應(yīng)延長染毒時間。本研究因為樣本量較少，實驗方法存在誤差和局限性，可增大樣本量，改善實驗方法以及實驗儀器的的精準度，降低實驗誤差。

綜上所述，NP對小鼠卵巢有生殖毒性和發(fā)育毒性。人類的生育功能下降，是否與NP在日常生活中的暴露量成正相關(guān)，還需進行大量的流行病學(xué)調(diào)查和論據(jù)充分有效的動物實驗。NP類化合物在生活中越來越多，有必要繼續(xù)進行相關(guān)的動物實驗，進一步關(guān)注和明確NP對人類及野生動物生殖健康的危害，從而更有效地預(yù)防。

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（收稿日期：2018-07-23? 本文編輯：許俊琴）