趙艷杰 黃思思 馮艷芳 馬瑩雪 李嬡嬡 張 蝶 鄧 超 韓瑞璽 唐 浩

（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心，北京100176）

大豆是我國(guó)主要的農(nóng)作物之一，在新品種保護(hù)申請(qǐng)量中占有較大比例。DUS測(cè)試（特異性、一致性、穩(wěn)定性）是植物新品種保護(hù)的技術(shù)基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。一致性是指一個(gè)植物品種的特征特性除可以預(yù)見(jiàn)的自然變異外，群體內(nèi)個(gè)體間其相關(guān)特征或者特性表現(xiàn)一致，是品種內(nèi)株與株之間的比較。大豆作為自花授粉作物，理論上通過(guò)6～7代自交后，品種的純合度可達(dá)到98%以上，但DUS測(cè)試經(jīng)?？吹饺后w內(nèi)差異明顯的現(xiàn)象。據(jù)統(tǒng)計(jì)，歷年來(lái)因?yàn)橐恢滦圆缓细裎赐ㄟ^(guò)授權(quán)的大豆品種占到了5.68%。

田間測(cè)試具有測(cè)試周期長(zhǎng)、易受環(huán)境影響等特點(diǎn)，因此，研究大豆分子標(biāo)記純合度對(duì)大豆一致性測(cè)試有一定的輔助作用。關(guān)榮霞等[1]利用30對(duì)SSR引物對(duì)2005-2009年參加國(guó)家區(qū)域試驗(yàn)的1068份大豆品種（系）的位點(diǎn)純合度進(jìn)行了分析，年平均純合度在94.9%～97.6%之間，且純合度低于85%的品種產(chǎn)量出現(xiàn)不同程度的降低。Guan等[2]用11個(gè)SSR標(biāo)記檢測(cè)3個(gè)大豆品種純度，雜合位點(diǎn)數(shù)分別為1個(gè)、9個(gè)、10個(gè)，說(shuō)明其中2個(gè)品種存在嚴(yán)重混雜。李英慧等[3]在我國(guó)2794份大豆資源中檢測(cè)出純度較低資源277份，其中16份為育成品種，為有效保存種質(zhì)遺傳完整性提供理論依據(jù)。Yan等[4]發(fā)現(xiàn)低純度大豆資源根據(jù)表型分離情況可在后代分離出不同的純系。因此，分子位點(diǎn)的雜合在一定程度上表現(xiàn)出品種的混雜。

本研究對(duì)2000-2017年度間申請(qǐng)保護(hù)的大豆品種常規(guī)種SSR位點(diǎn)純合度進(jìn)行系統(tǒng)分析總結(jié)，旨在明確我國(guó)申請(qǐng)保護(hù)的大豆品種常規(guī)種SSR位點(diǎn)純合度狀況，分析一致性不合格品種與SSR位點(diǎn)純合度的關(guān)系，為田間一致性測(cè)試及選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料本研究所用材料為2000-2017年度間申請(qǐng)品種保護(hù)的661份大豆品種常規(guī)種，其種子由農(nóng)業(yè)部植物新品種保藏中心提供。

1.2 DNA提取從每個(gè)品種中取50粒種子，放在裝有適量濕沙土的發(fā)芽盒中，置于人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長(zhǎng)成苗后，每個(gè)樣品隨機(jī)取約20片葉片，液氮研磨后用改良的CTAB法[5]提取DNA。

1.3 SSR標(biāo)記檢測(cè)與統(tǒng)計(jì)分析熒光引物為黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種研究所推薦的品種區(qū)分效果好、峰型易讀的40對(duì)SSR引物（英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成）。PCR體系含1×TaqMan?Gene Expression Master Mix、30ngDNA，加 ddH2O 補(bǔ)足20μL。PCR程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，60℃退火 45s，72℃延伸 45～90s，運(yùn)行 32 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10～15min，擴(kuò)增產(chǎn)物16℃條件下保存。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，取1μL稀釋液加8.5μL去離子甲酰胺、0.5μL Liz-500分子量?jī)?nèi)標(biāo)，于ABI 3730 DNA分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。利用北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米中心開(kāi)發(fā)的SSR指紋分析器采集擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小。每個(gè)品種在各位點(diǎn)的條帶單一表示該位點(diǎn)純合，如果在某位點(diǎn)出現(xiàn)2個(gè)及以上條帶，表示該位點(diǎn)雜合。SSR位點(diǎn)純合度=（檢測(cè)SSR位點(diǎn)數(shù)-雜合位點(diǎn)數(shù)）/檢測(cè)SSR位點(diǎn)總數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同年度品種SSR位點(diǎn)純合度變化對(duì)661份大豆品種的SSR位點(diǎn)純合度進(jìn)行分析，結(jié)果表明，2000-2017年度純合度大于95%的材料共有408份，占供試材料總數(shù)的61.725%；純合度在90.1%～95%之間的材料共有182份，占供試材料總數(shù)的27.534%；純合度在85%～90%之間的材料共有71份，占供試材料總數(shù)的10.741%。年平均純合度在95%～98.1%之間，其中，2002年的平均純合度最高，為98.1%，2001年最低，為95%。

表1 2000-2017年度檢測(cè)品種數(shù)及SSR位點(diǎn)純合度

2.2未通過(guò)田間一致性測(cè)試的大豆材料純合度分析661份大豆材料中，有8份材料在田間測(cè)試中不具備一致性，其中3份材料的純合度低于85%，4份在87.5%～90%之間，還有1份達(dá)到了95%（表2）。大豆常規(guī)種田間一致性測(cè)試采用至少95%的接受概率，按照這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)田間一致性測(cè)試結(jié)果表明：未通過(guò)田間一致性測(cè)試的材料大部分申請(qǐng)年份在2012年以后，說(shuō)明在2012年之前，申請(qǐng)者提交的材料不管是自交代數(shù)還是樣品的純度都有一定的保證。究其原因，可能是近幾年由于申請(qǐng)者出于利益等方面的考慮或者對(duì)DUS測(cè)試的不理解，導(dǎo)致申請(qǐng)材料在低自交代數(shù)或不注重樣品純度就急于申請(qǐng)保護(hù)，導(dǎo)致一致性不能通過(guò)而被駁回。

表2 未通過(guò)田間一致性測(cè)試的品種純合度

3 討論

植物DUS測(cè)試與品種分子純合度關(guān)系密切，品種自身自交代數(shù)不夠或種子混雜都會(huì)導(dǎo)致分子表現(xiàn)不純合，從而在田間鑒定時(shí)出現(xiàn)表型分離，影響一致性測(cè)試。張雪原等[6]利用20對(duì)SSR核心引物，對(duì)10個(gè)玉米品種進(jìn)行了一致性鑒定，結(jié)果表明，田間鑒定結(jié)果與SSR分子標(biāo)記鑒定結(jié)果相吻合的植株占83%。王俊等[7]對(duì)國(guó)家資源中期庫(kù)保存的2個(gè)大豆地方品種羊眼豆和毛豆的純度檢測(cè)表明，其SSR位點(diǎn)雜合率分別為44.8%和41.2%，單粒種子檢測(cè)證明這些材料可以被聚為不同的種類(lèi)，說(shuō)明SSR位點(diǎn)純合度可以反映大豆品種的純度。本研究對(duì)2000-2017年度申請(qǐng)保護(hù)的661份大豆品種分子純合度進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)大豆年平均分子純合度在95%～98.1%之間，相對(duì)較高，整體較好；在未通過(guò)一致性測(cè)試的8份大豆材料中發(fā)現(xiàn)，3份材料的純合度低于85%，4份在87.5%～90%之間，還有1份達(dá)到了95%。說(shuō)明SSR分子純合度情況在田間一致性測(cè)試上有一定的借鑒意義，但是若要真正判定申請(qǐng)材料是否具備一致性還需通過(guò)田間測(cè)試。

因此，為防止申請(qǐng)保護(hù)材料因純合度不夠影響申請(qǐng)者利益，建議育種家在高世代進(jìn)行單株選擇和繁殖，需提供育種家種子，以確保繁殖材料基因組的純合度。