● 程宛鈞 張敏建 史亞磊 危槧罡 江 澍 程標(biāo)建 詹華深 鄧日森 曾智承

弱精子癥是當(dāng)前引起男性不育癥的主要因素之一，其發(fā)生多與泌尿生殖道感染、內(nèi)分泌失調(diào)、精索靜脈曲張[1]、遺傳等因素相關(guān)[2]，藥物治療改善精液質(zhì)量是提高患者配偶妊娠成功率的有效途徑。臨床研究發(fā)現(xiàn)，精子線粒體結(jié)構(gòu)和功能均與男性不育癥患者精子活力呈正相關(guān)性[3，4]，在臨床評(píng)估精子質(zhì)量方面有一定應(yīng)用價(jià)值，部分學(xué)者還指出中醫(yī)藥在改善精液微觀成分方面有良好的優(yōu)勢[5]。因此，本研究選取腎虛夾濕型弱精子癥患者和生殖體檢者為研究對(duì)象，研究石萆湯對(duì)精子線粒體膜蛋白PHB和超微結(jié)構(gòu)的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2016年8月-2018年6月于福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院男科門診就診的腎虛夾濕型弱精子癥患者(60例)、生殖體檢正常者(30例)、生殖體檢弱精子者(30例)為研究對(duì)象。將生殖體檢其中正常者納入正常精液組(N組，n=30)，其年齡為(37.36±4.21)歲，體質(zhì)量(BWI)為(24.78±1.57)kg/m2檢測為弱精子但暫未要求給予治療者納為弱精子癥組(A組，n=30)，其年齡為(37.18±4.40)歲，BWI為(24.07±1.49)kg/m2，病史為(2.11±0.36)年；確診為腎虛夾濕型弱精子癥的60例患者作為石萆湯治療組(T組，n=60)，其年齡為(37.89±4.36)歲，BWI為(24.15±1.60)kg/m2，病史為(2.09±0.38)年。三組患者在年齡、體質(zhì)量(BWI)等一般資料對(duì)比上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，A組、T組在男性不育病史對(duì)比上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2納入標(biāo)準(zhǔn)①已婚或有固定性伴侶且共同生活12個(gè)月以上，性生活中未采取任何避孕措施而女方未受孕者；②西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《實(shí)用量科學(xué)》及文獻(xiàn)[6，7]中弱精子癥相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[8]中腎虛夾濕型弱精子癥相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)者；③20歲～50歲的男性；④臨床資料完整者；⑤參與研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)者；⑥自愿簽署知情同意書者。

1.3排除標(biāo)準(zhǔn)①合并先天性生殖系統(tǒng)發(fā)育不良或畸形、嚴(yán)重器質(zhì)性病變、自身免疫性疾病、生殖道感染疾病、內(nèi)分泌疾病、代謝性疾病、重要臟器功能不全者；②合并惡性腫瘤者；③合并精神疾病、意識(shí)障礙者；④拒絕參與本次研究者；⑤研究入組前90d使用影響性腺功能、睪丸生精功能的藥物者；⑥配偶或固定性伴侶確診為婦科不孕癥者；⑦過敏體質(zhì)或相關(guān)治療禁忌證者；⑧治療依從性不足者。

1.4方法

1.4.1 治療方法 A組主要予以健康宣教，暫未接受相關(guān)藥物治療措施；T組給予石萆湯：萆薢、石菖蒲、菟絲子、枸杞子各20g，黃芪30g，黃精、女貞子、連翹、墨旱蓮各15g，五味子、懷牛膝、覆盆子各10g，由我院全成分智能中藥房配制為中藥配方顆粒劑，每日1劑，分早晚兩次沖服，持續(xù)16周。

1.4.2 精液采集方法 三組受試者均自行采集精液，禁欲7d后在取精室內(nèi)經(jīng)手淫方式獲取全部精液并置入統(tǒng)一配發(fā)的一次性帶蓋取精杯內(nèi)；三組中A組及N組受試者入組時(shí)完成精液的采集工作，T組患者口服石萆湯16周后，按上述方法采集精液。

1.4.3 檢測方法

1.4.3.1 精液質(zhì)量檢測 將采集的精子靜置于37℃恒溫水浴箱中使之液化，記錄精液量；精子密度、精子(a+b)級(jí)活動(dòng)力、精子成活率等精子質(zhì)量指標(biāo)由男科實(shí)驗(yàn)室采用徐州北斗科貿(mào)公司生產(chǎn)的BD-8000G型計(jì)算機(jī)彩色精液分析儀(CASA)進(jìn)行分析。

1.4.3.2 精子線粒體膜蛋白PHB表達(dá)的熒光檢測 將一部分調(diào)整后細(xì)胞密度約為10×106/L的精子懸液，重懸于精子細(xì)胞BWW培養(yǎng)液中，在培養(yǎng)箱中處理45min之后徹底洗凈精子細(xì)胞用于線粒體熒光檢測試驗(yàn)。加入配置好的37℃預(yù)溫的Mito-Tracker染色液共孵育15min。洗滌去除MitoTracker染色液，加入37℃預(yù)溫的精子細(xì)胞BWW培養(yǎng)液。取干凈載玻片上加5μl經(jīng)MitoTracker染色后的精子懸液，取四角墊著適量凡士林的清潔蓋玻片壓片，使精子細(xì)胞盡量集中在蓋玻片中心區(qū)域且無擠靠，用羊毛脂密封住蓋玻片和載玻片接觸邊緣，室溫下晾干，置于暗處待測，在波長561nm激光LSCM下觀察紅色熒光并拍照。照片用Leica圖像分析軟件處理，比較熒光強(qiáng)度情況，分析精子線粒體膜蛋白PHB表達(dá)的強(qiáng)弱。

1.4.3.3 精子線粒體超微結(jié)構(gòu)檢測 參照文獻(xiàn)[3]將三組精液標(biāo)本移入細(xì)胞培養(yǎng)管，3000 r/min離心10min。棄上清液，將沉淀物用2.5%戊二醛固定，Epon812環(huán)氧樹脂包埋，半薄切片，甲苯胺藍(lán)染色，光鏡定位后超薄切片，用透射電子顯微鏡(Hu-12A，日本日立公司)重點(diǎn)觀察精子中段線粒體的改變情況并拍片。正常線粒體大小標(biāo)準(zhǔn)：精子線粒體直徑大小為0.5～1.0μm，呈橢圓形細(xì)胞器。排列規(guī)則，線粒體嵴可見，頭尾連接緊密正常[9]。

1.5主要觀察指標(biāo)觀察比較三組受試者精子質(zhì)量指標(biāo)[精液量、精子密度、精子(a+b)級(jí)活動(dòng)力、精子成活率]、精子細(xì)胞線粒體膜蛋白PHB熒光強(qiáng)度、陽性細(xì)胞比例以及精子細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS19.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1精子質(zhì)量指標(biāo)比較分析三組受試者除精液量比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外，N組受試者精子密度、精子(a+b)級(jí)活動(dòng)力及精子成活率均明顯高于A、T兩組，且T組上述指標(biāo)檢測結(jié)果明顯高于A組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 三組精子質(zhì)量指標(biāo)檢測結(jié)果比較

注：與N組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與A組比較，▲P<0.05

2.2三組精子線粒體功能評(píng)估分析經(jīng)MitoTracker熒光探針(圖中為紅色熒光)檢測顯示，N組精子染色可見棒狀精子中段結(jié)構(gòu)(見圖1-N組)，T組可見較短或屈曲的精子中段結(jié)構(gòu)(見圖1-T組)，A組可見變形的精子中段結(jié)構(gòu)(見圖1-A組)；A、T組精子熒光強(qiáng)度明顯弱于N組。見圖1。

圖1 三組患者精子線粒體膜蛋白PHB表達(dá)情況(激光波長561nm觀察紅色熒光)

通過圖像標(biāo)記計(jì)數(shù)，計(jì)算精子線粒體膜蛋白PHB陽性細(xì)胞比例。N組受試者精子線粒體膜蛋白PHB陽性細(xì)胞比例明顯高于A、T兩組，且T組高于A組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 三組精子線粒體膜蛋白PHB陽性細(xì)胞比例比較

注：與N組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與A組比較，▲P<0.05

2.3精子細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化經(jīng)透射電鏡對(duì)三組精子線粒體超微結(jié)構(gòu)的觀察發(fā)現(xiàn)N組精子線粒體鞘完整，軸絲及微管結(jié)構(gòu)清晰。A組精子呈現(xiàn)空泡狀，線粒體腫脹、大小不一，軸絲出現(xiàn)明顯斷裂，微管缺失。T組精子精子線粒體腫脹明顯減輕、線粒體鞘基本完整、軸絲微管結(jié)構(gòu)較完整。見圖2。

圖2 三組患者精子線粒體超微結(jié)構(gòu)變化情況

3 討論

據(jù)不完全資料統(tǒng)計(jì)，男性不育癥已成為影響社會(huì)新生人口增長的主要因素之一[10]，弱精子癥作為目前男性不育的常見致病因素，其臨床診療受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注[11]。

祖國醫(yī)學(xué)將弱精子癥納入“無子”“無嗣”范疇，認(rèn)為該疾病以腎精虧虛為本、濕阻精竅為標(biāo)[11]，需以益氣補(bǔ)腎、強(qiáng)精除濕為治法[12]，方可獲得理想的治療效果。石萆湯是福建省名中醫(yī)張敏建教授應(yīng)用多年的治療男性不育癥的經(jīng)驗(yàn)方，具有益腎強(qiáng)精、通竅除濕的功效，以利濕化濁的萆薢及化濕開竅、醒神益智的石菖蒲為君藥，輔以補(bǔ)腎生精的黃精、墨旱蓮、五味子、覆盆子、女貞子等臣藥可共奏強(qiáng)精益腎、利濕化濁的功效。本研究也發(fā)現(xiàn)，予以石萆湯口服16周治療的T組患者精子質(zhì)量評(píng)估指標(biāo)檢測結(jié)果均明顯優(yōu)于未接受相關(guān)治療的A組患者，同安琪等[13]報(bào)道的系統(tǒng)評(píng)價(jià)結(jié)論基本一致，證實(shí)石萆湯對(duì)改善男性不育腎虛夾濕型弱精子癥患者精子活力及質(zhì)量、促進(jìn)其病情轉(zhuǎn)歸等方面有積極作用。

精子線粒體是精細(xì)胞的重要細(xì)胞器，而精子線粒體膜蛋白PHB反映著精子線粒體的功能狀態(tài)，是其敏感指標(biāo)之一。因?yàn)榫泳€粒體同時(shí)介導(dǎo)精細(xì)胞的凋亡，主要表現(xiàn)為精子線粒體的膜蛋白PHB下降，逐步引起精子線粒體結(jié)構(gòu)的變化，而出現(xiàn)功能異常，精子的運(yùn)動(dòng)能力下降。本研究顯示，T組經(jīng)過石萆湯16周的治療，運(yùn)用LSCM以及透射電鏡的檢測觀察發(fā)現(xiàn)，有明顯增強(qiáng)精子線粒體膜蛋白PHB的作用(熒光強(qiáng)度增加)；改善精子線粒體結(jié)構(gòu)，趨于恢復(fù)至正常的精子結(jié)構(gòu)和形態(tài)。

綜上所述，石萆湯能夠?qū)嘿|(zhì)量尤其活率和活力方面有明顯的治療作用，其分子生物機(jī)制在于通過提高精子線粒體膜蛋白PHB表達(dá)來減弱精子細(xì)胞凋亡的發(fā)生，進(jìn)而改變精子線粒體的超微結(jié)構(gòu)，恢復(fù)和提高精子的運(yùn)動(dòng)能力，達(dá)到臨床上運(yùn)用石萆湯治療腎虛夾濕型弱精子癥的目的。