周燕霞 綜述，張鵬輝 審校

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院臨檢中心/兒童發(fā)育疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/兒童發(fā)育重大疾病國家國際技合作基地/認(rèn)知發(fā)育與學(xué)習(xí)記憶障礙轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400014)

葡萄糖-6-磷酸酶(G6PD)缺乏癥又稱為蠶豆病。希臘的兒科醫(yī)生最早發(fā)現(xiàn)食用蠶豆的兒童中可能出現(xiàn)嚴(yán)重的貧血和血紅蛋白尿。隨后，研究發(fā)現(xiàn)對(duì)羥喹啉敏感者的紅細(xì)胞缺乏G6PD酶，而G6PD缺乏癥可能受到瘧疾選擇，之后該領(lǐng)域的研究逐漸受到人們的關(guān)注。

G6PD缺乏癥主要發(fā)現(xiàn)于東南亞、非洲、中東和地中海沿岸，全世界約4億患者，男性多于女性[1]。我國G6PD缺乏癥的分布呈南高北低趨勢(shì)，廣東、廣西、海南等地人群患病率高。但隨著人口流動(dòng)性增加，患病率較低的地區(qū)也呈現(xiàn)增高趨勢(shì)。

1 G6PD缺乏癥

G6PD是一種從原核生物到動(dòng)物都存在的X染色體連鎖的胞質(zhì)酶。人類G6PD基因位于Xq28，長約20 kb，編碼515個(gè)氨基酸。G6PD缺乏癥是由于G6PD基因突變引起的，其突變主要集中在第4、5、6、8、10號(hào)外顯子[2]。人類基因突變數(shù)據(jù)庫(HGMD)與GMEZ-MANZO 等[3]報(bào)道的G6PD基因突變型為217種，多為單個(gè)堿基置換導(dǎo)致的錯(cuò)義突變，少數(shù)為無義突變、剪接突變和小缺失，已發(fā)現(xiàn)的所有突變都在基因的編碼區(qū)，且絕大多數(shù)影響蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[4]。我國人群中已發(fā)現(xiàn)G6PD基因突變位點(diǎn)超過20種，以95A>G,1 376G>T,1 388G>A最常見，占總突變的50%～60%[5]。

G6PD缺乏癥患者紅細(xì)胞膜表面的G6PD酶缺乏，這導(dǎo)致了紅細(xì)胞磷酸戊糖途徑中谷胱甘肽還原酶的輔酶-還原型輔酶Ⅱ(NADPH)生成減少，使得維持紅細(xì)胞膜穩(wěn)定性的還原型谷胱甘肽(GSH)減少而不能抵抗氧化損傷，最終導(dǎo)致紅細(xì)胞破壞并溶血[6]。WHO根據(jù)G6PD酶的活性缺乏程度及臨床表現(xiàn)，將該病分成Ⅰ～Ⅴ 5種亞型。G6PD缺乏癥臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重程度與酶功能障礙的等級(jí)相關(guān)[7]，主要分為新生兒黃疸、急性溶血性貧血和慢性非球形紅細(xì)胞溶血性貧血3類。

2 G6PD缺乏癥的預(yù)防與治療

G6PD缺乏癥患者多數(shù)平時(shí)無臨床癥狀，早期診斷和干預(yù)非常重要。在G6PD缺乏癥的高發(fā)地區(qū)，所有新生兒應(yīng)開展G6PD缺乏癥篩查和健康教育，禁用、慎用某些食物[8]及藥物(如抗瘧疾藥物[9]、磺胺類藥物、鎮(zhèn)痛藥、砜類藥物[10]、亞甲藍(lán)和萘等[11])。當(dāng)出現(xiàn)急性溶血時(shí)，應(yīng)立即停止接觸和攝入可疑食物和藥物并給予對(duì)癥治療，貧血較重時(shí)可輸注G6PD正常的紅細(xì)胞，防治腎衰竭。對(duì)于新生兒黃疸，根據(jù)膽紅素的水平及個(gè)體情況，給予藥物、藍(lán)光照射或換血療法，藍(lán)光治療是最常用且安全有效的方法，能有效降低膽紅素濃度，預(yù)防膽紅素腦病的發(fā)生。由G6PD缺乏所致的慢性非球形紅細(xì)胞溶血性貧血(CNSHA)患者，一般無特殊治療，但出現(xiàn)再障危象時(shí)輸血是救命的措施之一。

3 G6PD缺乏癥治療前景及展望

G6PD缺乏癥的本質(zhì)為基因突變，基因治療是其根本療法。近年來，成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列及相關(guān)蛋白9(CRISPR/Cas9)精確的基因編輯技術(shù)為基因治療開啟了新方向，可與誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(iPSCs)技術(shù)相結(jié)合，為患者定制個(gè)性化治療方案。

3.1iPSCs iPSCs是基因治療的理想細(xì)胞工具，是將一些多能遺傳基因?qū)氤墒祗w細(xì)胞中，使其重編程為與胚胎干細(xì)胞(ESC)具有相似特征的一種干細(xì)胞[12]，可以用于包括G6PD缺乏癥在內(nèi)等各種遺傳疾病的疾病建模。隨著iPSCs技術(shù)的出現(xiàn)，各種體細(xì)胞來源的iPSCs研究迅速出現(xiàn)[13-14]，證明了患者來源的iPSCs治療血液疾病如鐮狀細(xì)胞貧血和地中海貧血癥的潛力。使用基因編輯技術(shù)，通過糾正源于患者的iPSCs中潛在的致病性突變來構(gòu)建臨床相關(guān)的治愈性干細(xì)胞，然后將其分化為所需的祖細(xì)胞用于植入和細(xì)胞替代療法。

3.2CRISPR/Cas9系統(tǒng) CRISPR/Cas9是新出現(xiàn)的一種由RNA指導(dǎo)Cas9核酸酶對(duì)靶基因進(jìn)行編輯的基因編輯系統(tǒng)，是細(xì)菌和古細(xì)菌在長期演化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)[15]。其原理為crRNA(CRISPR-derived RNA)通過堿基配對(duì)與tracrRNA(trans-activating RNA)結(jié)合形成tracrRNA/crRNA復(fù)合物，此復(fù)合物引導(dǎo)Cas9蛋白在與crRNA配對(duì)的序列靶位點(diǎn)剪切雙鏈DNA。通過人工設(shè)計(jì)這兩種RNA，可改造成具有引導(dǎo)作用的sgRNA(singleguide RNA)，引導(dǎo)Cas9對(duì)DNA的定點(diǎn)切割。原型間隔序列毗鄰基序(PAM)是CRISPR/Cas9至關(guān)重要的一部分，序列為5′-NGG-3′[16]。PAM區(qū)是一段高度保守的序列，它在識(shí)別靶向DNA中有重要的作用，只有靶序列位于PAM的5′端附近時(shí)，Cas9才對(duì)靶序列進(jìn)行切割。

與已經(jīng)開發(fā)了的其他基因編輯技術(shù)相比，Cas9核酸酶是已知的第1個(gè)能夠共定位RNA、DNA和蛋白質(zhì)的分子，其特點(diǎn)包括：(1)易于設(shè)計(jì)，可人工設(shè)計(jì)與目的序列互補(bǔ)的20-nt的引導(dǎo)序列sgRNA；(2)特異性高，不同的sgRNA可引導(dǎo)Cas9酶對(duì)DNA的定點(diǎn)切割；(3)成本低，周期短；(4)適合于多種細(xì)胞類型和生物體的高通量和多路基因編輯的系統(tǒng)[17]；(5)脫靶效率高且目的序列5′到3′端需靠近PAM區(qū)等。通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)基因插入、敲除、定點(diǎn)替換及染色體重組等，這為生物體的研究和改造帶來了巨大潛力。

3.3CRISPR/Cas9技術(shù)在遺傳性疾病中的應(yīng)用 CRISPR/Cas9作為可編程系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)后，相關(guān)應(yīng)用研究迅速升溫，從農(nóng)作物編輯、轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳學(xué)調(diào)控到各種疾病治療等方面均得到應(yīng)用，目前，用于癌癥治療[18]和降低HIV病毒載量[19]的Ⅰ期臨床試驗(yàn)正在積極開展，應(yīng)用前景十分廣闊。由于其強(qiáng)大的基因組編輯能力，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)領(lǐng)域是遺傳性疾病。該技術(shù)常應(yīng)用于多種遺傳性疾病，如杜氏肌營養(yǎng)不良[20]、α1-抗胰蛋白酶缺乏癥[21]、Crygc基因突變引發(fā)的白內(nèi)障[22]、X連鎖慢性肉芽腫病[23]、囊性纖維化[24]等。

在血液系統(tǒng)遺傳性疾病中，OHMORI等[25]利用CRISPR/Cas9技術(shù)在體內(nèi)創(chuàng)建和校正了血友病B的小鼠模型，為其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。XIE等[26]利用CRISPR/Cas9修復(fù)地中海貧血患者來源的iPSCs中的致病基因，并將修復(fù)后的iPSCs誘導(dǎo)分化成紅細(xì)胞，檢測(cè)此細(xì)胞能產(chǎn)生正常的β-球蛋白，解決了地中海貧血癥所引起的病變。HUANG等[27]用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)鐮狀細(xì)胞性貧血患者iPSCs的HBB基因進(jìn)行基因編輯，基因修正后的iPSCs可以誘導(dǎo)分化至網(wǎng)織紅細(xì)胞階段，且表達(dá)正常的β-球蛋白。這些研究都提示利用CRISPR/Cas9聯(lián)合iPSCs技術(shù)治療G6PD缺乏癥的可行性。

3.4CRISPR/Cas9應(yīng)用于G6PD缺乏癥 SPENCER等[28]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)產(chǎn)生了G6PD基因敲除體細(xì)胞(肝)細(xì)胞系，敲除G6PD基因后G6PD表達(dá)下降，提示CRISPR/Cas9系統(tǒng)可用于G6PD基因組的編輯。TANG等[29]運(yùn)用合適的sgRNA和同源供體復(fù)合的Cas9蛋白注射入單細(xì)胞人胚胎中，證明有效的同源重組可介導(dǎo)G6PD基因中點(diǎn)突變的校正。已報(bào)道G6PD基因突變中約83.9%為單基因突變，其中約一半為WHO-Ⅰ型，可導(dǎo)致嚴(yán)重的慢性溶血性貧血，臨床治療效果不佳[5]。根據(jù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯原理，sgRNA可引導(dǎo)Cas9蛋白在PAM區(qū)上游的3～8堿基處切割目的DNA[30]，則利用CRISPR/Cas9技術(shù)可修復(fù)G6PD缺乏癥的大部分突變位點(diǎn)，包括95A>G,1 376G>T、1 024C>T等我國最常見的幾種突變。人工設(shè)計(jì)針對(duì)導(dǎo)致G6PD缺乏癥突變位點(diǎn)的特異性sgRNA，引導(dǎo)Cas9蛋白對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行切割，同時(shí)提供DNA 修復(fù)模板進(jìn)行同源修復(fù)(HDR)，達(dá)到修復(fù)突變位點(diǎn)的目的?？蓪6PD缺乏癥患者的體細(xì)胞重編程為iPSCs，利用CRISPR/Cas9技術(shù)修復(fù)G6PD缺乏癥患者來源的iPSCs中的致病突變，再將修復(fù)后的iPSCs誘導(dǎo)分化為紅系祖細(xì)胞移植到G6PD缺乏癥患者體內(nèi)，達(dá)到治療的目的。

總之，CRISPR/Cas9系統(tǒng)聯(lián)合iPSCs技術(shù)是一種治療G6PD缺乏癥的理想策略。該系統(tǒng)作為遺傳性疾病新型治療技術(shù)的前沿，具有廣闊的應(yīng)用前景。