射頻消融技術(shù)聯(lián)合TACE誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制

邢燕來(lái) 王曉磊

目前對(duì)原發(fā)性肝癌(Primary hepatic carcinoma，PHC)的治療仍以外科治療為主，但是其術(shù)后并發(fā)癥較多，患者預(yù)后狀況較差[1-2]。射頻消融技術(shù)(radiofrequency ablation，RFA)將射頻電極插入腫瘤中并輸出能量，提高細(xì)胞內(nèi)的溫度至90℃，從而毀損腫瘤細(xì)胞[3-4]。TACE術(shù)(transcatheter arterial chemoembolization)多用于治療肝癌[5-6]。新型長(zhǎng)鏈非編碼 RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是長(zhǎng)度超過(guò)200 核苷酸(nucleotide，nt)的調(diào)節(jié)性非編碼 RNA，其在肝癌、喉癌和直腸癌中起關(guān)鍵作用[7-8]。本研究即探討新型長(zhǎng)鏈非編碼RNA在肝癌中潛在的生物學(xué)功能和機(jī)制。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選取2014年1月至2015年12月期間來(lái)我院就診的185例肝癌患者作為研究對(duì)象。所選185例肝癌患者中男性患者105例，女性患者80例，年齡48～78歲，平均年齡(64.30±5.17)歲。所有參試者均自愿簽訂同意書，配合參加本次研究。受試者分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，試驗(yàn)組(n=95)實(shí)施冷循環(huán)射頻術(shù)聯(lián)合TACE術(shù)，對(duì)照組(n=90)實(shí)施傳統(tǒng)手術(shù)切除。入選標(biāo)準(zhǔn)：臨床診斷肝癌患者；無(wú)其他腫瘤疾病及免疫系統(tǒng)疾病病史；其他身體指標(biāo)符合正常標(biāo)準(zhǔn)。剔除標(biāo)準(zhǔn)：近期做過(guò)大型手術(shù)；接受過(guò)放療或者化療等治療方法；不能配合完成試驗(yàn)者。本研究已經(jīng)獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且受試者均已簽署書面知情同意書。

二、治療方法

(一)受試者實(shí)施冷循環(huán)射頻術(shù)聯(lián)合TACE術(shù)。即先給予患者TACE治療，使用Seldinger 行股動(dòng)脈穿刺插管，于DSA下實(shí)施腫瘤供養(yǎng)動(dòng)脈造影，選取吡喃阿霉素60 mg、碘化油30 mL混合乳化物行栓塞治療，然后導(dǎo)管灌注卡鉑300 mg。TACE治療1周后，再進(jìn)行RFA 減瘤治療(LDRF-120S射頻消融治療儀)。RFA針刺入腫瘤中心，消融針展適合直徑，行重疊消融減瘤治療，消融范圍延伸周邊正常組織1 cm位置。收集患者的肝癌組織標(biāo)本，采用熒光定量檢測(cè)的方法得到患者癌組織標(biāo)本的RNA表達(dá)量[7-8]。對(duì)照組實(shí)施傳統(tǒng)手術(shù)切除腫瘤組織。

(二)采用應(yīng)用q-PCR檢測(cè)(美國(guó) Primerdesign公司Q-PCR試劑盒；用GAPDH基因作為內(nèi)參)方法檢測(cè)患者癌組織標(biāo)本的長(zhǎng)鏈非編碼RNA- AK054978及長(zhǎng)鏈非編碼RNA- FER1L4在肝癌患者肝癌組織及癌旁組織中的表達(dá)水平。熱循環(huán)采用Tach-down程序：94℃ 5 min -(94 ℃ 20 s ～ 65 ℃ 1 min ～ 72 ℃ 2 min)1個(gè)循環(huán),然后退火溫度每循環(huán)降低1℃ ,降至61℃時(shí)進(jìn)行36個(gè)循環(huán)。設(shè)定在每個(gè)循環(huán)72℃延伸后期收集熒光數(shù)據(jù)。熱循環(huán)完成后進(jìn)行60℃～95℃的融解曲線測(cè)定。

(三)構(gòu)建長(zhǎng)鏈非編碼RNA- AK054978及長(zhǎng)鏈非編碼RNA- FER1L4的質(zhì)粒，分別電轉(zhuǎn)染SMMC-7721人體肝癌細(xì)胞株(美國(guó)ATCC公司)。運(yùn)用Transwell 小室(德國(guó) 默克密理博公司)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞的組織生物學(xué)特性，對(duì)比分析癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染后組織細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲能力。Transwell 小室上室面用 Matrigel(50 mg/L)按 1∶8 稀釋液包被后以 FN 涂抹在小室下面并干燥，紫外線消毒 30 min。各孔加入 1% BSA 無(wú)血清培養(yǎng)基 0.1 mL，Matrigel充分浸潤(rùn)后吸掉殘余培養(yǎng)基。制備細(xì)胞懸液，將細(xì)胞濃度調(diào)整為 1×106個(gè)/mL，細(xì)胞懸液 0.2 mL(1×105)加于預(yù)包被培養(yǎng)板各孔，于下室緩慢加入 10 % FBS 培養(yǎng)基 0.5 mL，溫箱培養(yǎng) 16 h。用棉簽將 Transwell 小室上室面未穿過(guò)基底層膜的細(xì)胞擦去，注意不要破壞基底層膜，顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)細(xì)胞并比較。通過(guò)流式細(xì)胞儀(北京博奧CytoNova系列流式細(xì)胞儀)檢測(cè)各組肝癌細(xì)胞凋亡變化[7-8]。將待測(cè)細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，離心棄上清，沿管壁緩慢加入700 mL/L預(yù)冷 (-20 ℃)乙醇固定，上機(jī)檢測(cè)前RNA酶消化，再加入PI染色液，4 ℃避光30 min，使用FCM檢測(cè)凋亡率及細(xì)胞周期。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、試驗(yàn)前，對(duì)所有肝癌患者的基本臨床資料進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計(jì)，試驗(yàn)組(n=95)，性別(男/女)為50/45，平均年齡為(50.32±8.96)歲；分化程度低者18例、分化程度中者32例、分化程度高者45例，淋巴轉(zhuǎn)移陽(yáng)性者60例、淋巴轉(zhuǎn)移陰性者35例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移陽(yáng)性者51例、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移陰性者44例；對(duì)照組(n=90)，性別(男/女)為47/43，，平均年齡為(48.85±9.62)歲，分化程度低者16例、分化程度中者28例、分化程度高者46例，淋巴轉(zhuǎn)移陽(yáng)性者57例、淋巴轉(zhuǎn)移陰性者33例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移陽(yáng)性者47例、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移陰性者43例。各組受試者的一般情況進(jìn)行比較，結(jié)果顯示無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。此外，研究過(guò)程中所有受試者均完成了全部試驗(yàn)，無(wú)中途退出者，亦無(wú)改用其他療法者。

二、TACE聯(lián)合射頻消融治療后CT顯示：射頻消融后復(fù)查，見(jiàn)病灶大范圍壞死，但是腫瘤內(nèi)側(cè)及外側(cè)均見(jiàn)結(jié)節(jié)狀強(qiáng)化，提示腫瘤有殘余。新型長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)在肝癌患者癌組織中的表達(dá)量高于與其對(duì)應(yīng)的癌旁組織。經(jīng)過(guò)β-actin均一化后，得到兩種lncRNA在不同組織中的相對(duì)定量(ΔCt= Ct lncRNA-Ct β-actin)。試驗(yàn)組(n=95)：AK054978(Ct)為35.35，F(xiàn)ER1L4(Ct)為25.15，β-actin 為18.32，AK054978(ΔCt)為17.03±5.21，F(xiàn)ER1L4(ΔCt)為6.83±4.23；對(duì)照組(n=90)：AK054978(Ct)為32.26，F(xiàn)ER1L4(Ct)為30.36，β-actin 為19.01，AK054978(ΔCt)為13.25±4.87，F(xiàn)ER1L4(ΔCt)為為11.35±4.22。對(duì)比AK054978、FER1L4在兩種組織中的表達(dá)差異，肝癌組織中AK054978的表達(dá)明顯提高，屬于上調(diào)型(P<0.01)，相反，F(xiàn)ER1L4的表達(dá)顯著下降，屬于下調(diào)型(P<0.01)。

三、對(duì)肝癌患者癌組織的生物學(xué)功能進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)AK054978 轉(zhuǎn)染組：細(xì)胞增殖(OD)為6.92，細(xì)胞凋亡(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)為1.68，發(fā)生細(xì)胞遷移者為50例，發(fā)生細(xì)胞侵襲者為38例；FER1L4轉(zhuǎn)染組：細(xì)胞增殖(OD)為3.89，細(xì)胞凋亡(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)為1.04，發(fā)生細(xì)胞遷移者為0例，發(fā)生細(xì)胞侵襲者為0例，即長(zhǎng)鏈非編碼RNA- AK054978可以加速肝癌中細(xì)胞的繁殖，增強(qiáng)細(xì)胞遷移、侵襲能力；通過(guò)流式細(xì)胞儀觀察發(fā)現(xiàn)AK054978 轉(zhuǎn)染組凋亡率低、FER1L4轉(zhuǎn)染組凋亡率高，即上調(diào)長(zhǎng)鏈非編碼RNA- AK054978的表達(dá)可以減少肝癌細(xì)胞凋亡。

討 論

RFA具有創(chuàng)傷很小，療效比較確切，并發(fā)癥少，住院時(shí)間短[9-10]。TACE可阻斷腫瘤的絕大多數(shù)血供，致使腫瘤缺氧，抑制腫瘤生長(zhǎng)、促使腫瘤壞死[11]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200nt的RNA分子，lncRNA被轉(zhuǎn)錄在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。lncRNA多具有內(nèi)在的RNA介導(dǎo)的功能轉(zhuǎn)化[12]。

ACE聯(lián)合經(jīng)皮肝穿射頻消融術(shù)(RFA)可明顯提高患者的1年和2年生存率；經(jīng)TACE聯(lián)合經(jīng)皮肝穿射頻消融術(shù)治療后患者的中位生存期明顯長(zhǎng)于單獨(dú)TACE治療的患者，說(shuō)明TACE聯(lián)合經(jīng)皮肝穿射頻消融術(shù)可在一定程度上延長(zhǎng)患者的生命。

新型長(zhǎng)鏈非編碼RNA在肝癌患者癌組織中的表達(dá)量高于與其對(duì)應(yīng)的癌旁組織，與TNM分期、細(xì)胞分化、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)聯(lián)。為了研究新型長(zhǎng)鏈非編碼RNA在肝癌中的潛在生物學(xué)功能特性及其分子機(jī)制，研究者建立兩種RNA表達(dá)量不同的肝癌穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，其中AK054978的表達(dá)明顯提高，屬于上調(diào)型；FER1L4的表達(dá)顯著下降，屬于下調(diào)型。將兩種RNA細(xì)胞分別導(dǎo)入癌細(xì)胞組織中，運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞的組織生物學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)上調(diào)lncRNA可以加速肝癌中細(xì)胞的繁殖，增強(qiáng)細(xì)胞遷移、侵襲能力。利用自噬抑制劑3-MA，通過(guò)流式細(xì)胞儀觀察兩種細(xì)胞的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)上調(diào)RNA的表達(dá)可以使肝癌中細(xì)胞發(fā)生自我吞噬從而減少細(xì)胞凋亡；經(jīng)倒置電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)：下調(diào)RNA表達(dá)量的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了變化，有逆轉(zhuǎn)的趨勢(shì)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA不僅只具有基因組轉(zhuǎn)錄的功能，還具備重要的細(xì)胞和分子生物學(xué)功能。其可通過(guò)影響基因組的轉(zhuǎn)錄過(guò)程和表觀遺傳信號(hào)改變腫瘤的發(fā)生發(fā)展，潛在的分子生物學(xué)功能主要有：調(diào)控蛋白活性、改變RNA的模式、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄模式等。

綜上所述，長(zhǎng)鏈非編碼RNA的表達(dá)與肝癌的產(chǎn)生和發(fā)展有著密不可分的聯(lián)系；冷循環(huán)射頻聯(lián)合TACE通過(guò)抑制新型長(zhǎng)鏈非編碼RNA表達(dá)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。