聶然 郭天奇 李雪 裴婷婷 秦勤 周延民

吉林大學(xué)口腔醫(yī)院種植中心 長(zhǎng)春 130021

組織蛋白酶（cathepsin）最早于1929年由Willst?tte和Bamann首次發(fā)現(xiàn)并命名，是一種廣泛存在于溶酶體中的蛋白質(zhì)水解酶，具有維持細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)平衡的作用。目前在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的組織蛋白酶共有15種，包括2種絲氨酸蛋白酶（組織蛋白酶A、G）、11種半胱氨酸蛋白酶（組織蛋白酶B、C、F、H、K、L、V、O、S、W、Z）以及2種天冬氨酸蛋白酶（組織蛋白酶D、E）。組織蛋白酶除了可以降解蛋白質(zhì)，還可以通過水解作用活化細(xì)胞內(nèi)某些蛋白質(zhì)的前體，或激活其他蛋白質(zhì)水解酶系統(tǒng)，從而參與抗原加工、骨基質(zhì)降解、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等生理活動(dòng)[1]。

組織蛋白酶在細(xì)胞外的異常表達(dá)與腫瘤、心腦血管疾病、骨質(zhì)疏松癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牙周炎等大量病理狀態(tài)密切相關(guān)[1]。牙周炎是成人牙齒喪失的首要原因，其造成牙周支持組織的破壞與多種組織蛋白酶相關(guān)。本文就與牙周炎致病相關(guān)的組織蛋白酶K、B、C、G進(jìn)行綜述。

1 組織蛋白酶

1.1 組織蛋白酶K

組織蛋白酶K是溶酶體半胱氨酸蛋白酶家族的成員，是一種屬于C1A家族的番木瓜蛋白酶，為肽鏈內(nèi)切酶。組織蛋白酶K由染色體1q21上大約12.1 kb的基因組編碼，具有8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子。組織蛋白酶K是由329個(gè)氨基酸構(gòu)成的多肽序列，包含15個(gè)氨基酸構(gòu)成的N-末端，99個(gè)氨基酸構(gòu)成的前肽和215個(gè)氨基酸構(gòu)成的催化單元。

組織蛋白酶K存在帶高度正電荷的堿性殘基，可引起帶負(fù)電荷的糖胺聚糖（glycosaminoglycan）進(jìn)行變構(gòu)調(diào)節(jié)，形成組織蛋白酶K和糖胺聚糖的高分子低聚復(fù)合物，這是組織蛋白酶K具有獨(dú)特的膠原降解活性的基礎(chǔ)，其膠原酶活性高度依賴于復(fù)合物中糖胺聚糖的性質(zhì)和濃度[2]。

組織蛋白酶K是除基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）外，能夠在中性pH條件下完全降解三螺旋膠原結(jié)構(gòu)的少數(shù)蛋白酶之一，還可以水解明膠、彈性蛋白和骨粘連蛋白[3]。

眾所周知，Ⅰ型膠原是構(gòu)成骨基質(zhì)的主要有機(jī)成分，因此組織蛋白酶K與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、牙周炎等骨代謝疾病密切相關(guān)。組織蛋白酶K最初被認(rèn)為僅在破骨細(xì)胞中特異性表達(dá)，然而近年來研究發(fā)現(xiàn)，組織蛋白酶K的表達(dá)廣泛存在于人體的細(xì)胞、組織及器官中。

牙周炎的發(fā)生、發(fā)展涉及一系列免疫炎癥反應(yīng)，進(jìn)而出現(xiàn)牙齦炎癥出血、牙槽骨吸收、牙松動(dòng)脫落等表現(xiàn)。其中，破骨細(xì)胞、免疫細(xì)胞（T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等）、細(xì)胞因子等在該病理過程中發(fā)揮重要作用。組織蛋白酶K在牙周炎中的破骨作用已被公認(rèn)，而其在免疫反應(yīng)中的作用也得到初步探究。

組織蛋白酶K是破骨細(xì)胞的主要標(biāo)志物之一，在活化的破骨細(xì)胞中高度表達(dá)，通過降解骨基質(zhì)中的Ⅰ型膠原調(diào)節(jié)骨吸收[4]。在病理狀態(tài)下，組織蛋白酶K活性增強(qiáng)，骨吸收大于骨形成，導(dǎo)致了牙槽骨基質(zhì)的降解。核因子-κB受體活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）-核因子-κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）信號(hào)通路作為骨代謝的關(guān)鍵通路，使成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞發(fā)生偶聯(lián)。其中RANK與核因子（nuclear factor，NF）-κB、活化T細(xì)胞核因子（nuclear factor of activated T cell，NFAT）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）等下游信號(hào)通路結(jié)合，可調(diào)控破骨細(xì)胞的激活。Mogi等[5]發(fā)現(xiàn)，牙周炎患者齦溝液中組織蛋白酶K的濃度高于健康者，并且組織蛋白酶K與RANKL水平呈正相關(guān)，認(rèn)為RANKL的過量表達(dá)導(dǎo)致破骨細(xì)胞活化和組織蛋白酶K產(chǎn)生，誘導(dǎo)了牙周疾病破骨性骨吸收。Li等[6]研究表明，組織蛋白酶K啟動(dòng)子中存在NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)，認(rèn)為NF-κB途徑是介導(dǎo)破骨細(xì)胞表達(dá)組織蛋白酶K的關(guān)鍵通路。Balkan等[7]的研究表明，組織蛋白酶K轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上方存在NFAT結(jié)合位點(diǎn)，由此NFAT可對(duì)組織蛋白酶K的表達(dá)起調(diào)控作用。Kamolmatyakul等[8]認(rèn)為，白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1α可通過NF-κB途徑激活破骨細(xì)胞中組織蛋白酶K的過度表達(dá)，引起牙周炎等骨吸收疾病。

綜上，根據(jù)經(jīng)典的RANK-RANKL信號(hào)通路，組織蛋白酶K引起牙周炎牙槽骨吸收的機(jī)制為：在生理?xiàng)l件下，成骨細(xì)胞產(chǎn)生的RANKL與破骨細(xì)胞前體表面的RANK相結(jié)合，誘導(dǎo)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（tumor necrosis factor receptorassociated factor，TRAF）募集與激活，從而激活多重信號(hào)通路（如NF-κB、NFAT）級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化[9]；在局部炎癥等病理?xiàng)l件下，促炎因子（如IL-1α等）可刺激RANKL的表達(dá)增加[10]，進(jìn)而通過NF-κB途徑、NFAT途徑等激活組織蛋白酶K的過度表達(dá)，從而引起骨基質(zhì)降解。

近年來發(fā)現(xiàn)，組織蛋白酶K除了在破骨過程中發(fā)揮重要作用外，也參與了牙周炎的免疫炎癥反應(yīng)過程。Hao等[11-12]通過將組織蛋白酶K特異性抑制劑作用于牙周炎模型小鼠上，得出應(yīng)用抑制劑可減少牙周炎損傷區(qū)破骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞的數(shù)量，以及抑制牙周炎牙齦上皮細(xì)胞中Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）4、5、9及炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，提示組織蛋白酶K抑制劑的應(yīng)用可減少牙周炎進(jìn)程中的骨喪失和免疫炎癥反應(yīng)，減緩牙周組織病變。通過對(duì)比類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和牙周炎小鼠病理過程，證明組織蛋白酶K介導(dǎo)的兩種疾病免疫應(yīng)答機(jī)制相似。Chen等[13]研究發(fā)現(xiàn)，組織蛋白酶K基因沉默的小鼠不僅可以減少破骨細(xì)胞產(chǎn)生的骨吸收，還能通過改變炎性細(xì)胞因子的表達(dá)及T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的數(shù)量，大大減少牙周組織炎癥。由此看來，組織蛋白酶K參與牙周炎的免疫反應(yīng)初步得到證實(shí)，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

1.2 組織蛋白酶B

組織蛋白酶B是溶酶體半胱氨酸蛋白酶家族中第一個(gè)被確定結(jié)構(gòu)的酶。組織蛋白酶B與組織蛋白酶K同屬于番木瓜C1A家族。編碼組織蛋白酶B的基因大約27 kb，由13個(gè)外顯子（包括在外顯子2和3之間新發(fā)現(xiàn)的2a/2b）和11個(gè)內(nèi)含子組成，位于染色體8q22[14]。組織蛋白酶B是由339個(gè)氨基酸構(gòu)成的酶原轉(zhuǎn)變而來。

組織蛋白酶B是少見的同時(shí)具有肽鏈內(nèi)切酶和肽鏈外切酶活性的蛋白酶，其多酶活性得益于獨(dú)特的“閉合環(huán)”結(jié)構(gòu)。在溶酶體的酸性條件下，“閉合環(huán)”在酶活性位點(diǎn)閉合，表現(xiàn)為肽鏈外切酶；在中性條件下，“閉合環(huán)”開放，表現(xiàn)為肽鏈內(nèi)切酶；在堿性條件下，組織蛋白酶B失活[15-16]。正是由于其具有雙重蛋白質(zhì)水解活性，可直接或間接參與多種細(xì)胞外基質(zhì)（如多型膠原和彈性蛋白）的降解。在生理狀態(tài)下，組織蛋白酶B在體內(nèi)的表達(dá)在多層次水平上被嚴(yán)格調(diào)控；在病理狀態(tài)下，調(diào)節(jié)發(fā)生改變，溶酶體膜穩(wěn)定性下降，過量表達(dá)的組織蛋白酶B會(huì)介導(dǎo)細(xì)胞炎癥性壞死和細(xì)胞凋亡[17]。研究發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶B與惡性腫瘤、胰腺炎、牙周炎、阿爾茲海默癥等疾病中細(xì)胞的大量壞死和凋亡關(guān)系密切。

盡管組織蛋白酶B在牙周炎發(fā)生、發(fā)展中的具體機(jī)制尚未完全闡明，但眾多研究結(jié)果顯示，組織蛋白酶B與牙周炎的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。成纖維細(xì)胞廣泛存在于牙周結(jié)締組織中，通過產(chǎn)生膠原在組織修復(fù)中發(fā)揮重要作用。

Cox等[18]發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的慢性牙周炎患者的成纖維細(xì)胞中，組織蛋白酶B高水平表達(dá)。Li等[19]發(fā)現(xiàn)，慢性牙周炎患者牙齦組織中TLR2和組織蛋白酶B高度表達(dá)，與Kennett等[20]發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶B在炎性牙齦組織高表達(dá)相一致。Li等[19]用牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis）脂多糖（lipopoly-saccharide，LPS）刺激成纖維細(xì)胞，作用3、12 h組織蛋白酶B表達(dá)無組織學(xué)差異；作用24、48 h組織蛋白酶B的表達(dá)顯著升高，NF-κB抑制蛋白α（inhibitor of nuclear factor-κB α，IκBα）逐漸下降，Ⅲ型、Ⅳ型膠原顯著降低。作者認(rèn)為可能的機(jī)制為，組織蛋白酶B在細(xì)菌感染的急性和中期階段未增加，而是通過慢性活化TLR2/NF-κB通路，調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞中膠原表達(dá)。LPS是TLR4和TLR2的有效配體[21]，TLR2識(shí)別牙齦卟啉單胞菌的LPS后，可通過系列反應(yīng)使IκBα發(fā)生磷酸化后被組織蛋白酶B降解，從而慢性活化NF-κB通路，降解Ⅲ型和Ⅳ型膠原[19,22]。Ⅲ型膠原是構(gòu)成牙周結(jié)締組織的第二大組成部分，因此認(rèn)為組織蛋白酶B可以通過此機(jī)制和通路造成牙周組織的損傷。然而，李倩等[23]通過唾液蛋白酶譜檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，慢性牙周炎患者的組織蛋白酶B表達(dá)較牙周健康者低。

由此看來，組織蛋白酶B在體內(nèi)的調(diào)節(jié)是一個(gè)復(fù)雜的過程，具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明晰，不同研究所測(cè)得組織蛋白酶B的含量可能與體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)、牙周炎進(jìn)展時(shí)期等多種條件因素相關(guān)，現(xiàn)階段可證明組織蛋白酶B與牙周炎發(fā)生、發(fā)展具有相關(guān)性，但具體相關(guān)程度及機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

1.3 組織蛋白酶C

組織蛋白酶C屬于溶酶體半胱氨酸蛋白酶，是番木瓜蛋白酶家族成員。編碼組織蛋白酶C的基因由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子組成，定位于染色體11q14-21。組織蛋白酶C是463個(gè)氨基酸組成的序列，又被稱為二肽基酶，能夠去除肽鏈末端的二肽，同時(shí)具有肽鏈內(nèi)切酶的活性[24]。

組織蛋白酶C對(duì)于嗜中性粒細(xì)胞顆粒相關(guān)的絲氨酸蛋白酶翻譯后的修飾十分重要；還可以激活淋巴細(xì)胞的顆粒酶，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[25]。它在中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及前體、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞中高度表達(dá)，與免疫調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)降解、酶原激活等機(jī)體活動(dòng)密切相關(guān)[24]。

組織蛋白酶C與掌跖角化-牙周破壞綜合征（Papillon-Lefèvre syndrome，PLS）關(guān)系密切。PLS是一種常染色體隱性遺傳病，特點(diǎn)是手掌足底過度角化和早期重度牙周炎。組織蛋白酶C基因突變被認(rèn)為是PLS的致病基礎(chǔ)[24]。王津津[26]研究發(fā)現(xiàn)，組織蛋白酶C在牙齦炎組和牙周炎組牙齦中的表達(dá)明顯高于健康牙周組，伴隨著細(xì)胞分化狀態(tài)（CK19和CK10表達(dá)增加）和免疫狀態(tài)（TLR4增加）的改變。在組織蛋白酶C基因中現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)70余種致病突變。

組織蛋白酶C激活蛋白酶需進(jìn)行N-末端氨基酸的剪切，然而當(dāng)組織蛋白酶C功能失活時(shí)，表達(dá)組織蛋白酶C較高的天然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞、T細(xì)胞等缺乏激活的顆粒酶A和B，其功能發(fā)生障礙，使機(jī)體抵抗病原體能力受損，從而使機(jī)體易感性增加[25]。有趣的是，Khan等[27]報(bào)道了已發(fā)現(xiàn)5例無組織蛋白酶C基因突變的PLS患者。由此看來，組織蛋白酶C能否作為PLS早期的篩查手段現(xiàn)還有待進(jìn)一步考證。另外，Türko?lu等[28]研究表明，在慢性牙周炎、廣泛侵襲性牙周炎、牙齦炎患者齦溝液中未發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶C與牙周病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。因此，組織蛋白酶C在牙周組織炎癥反應(yīng)中扮演的重要角色以及作用機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

1.4 組織蛋白酶G

不同于上述溶酶體半胱氨酸蛋白酶，組織蛋白酶G是絲氨酸蛋白酶家族的一員，在嗜中性粒細(xì)胞中廣泛表達(dá)，也發(fā)現(xiàn)其在肥大細(xì)胞和單核細(xì)胞中表達(dá)，參與主要組織相容性復(fù)合物（major histocompability complex，MHC）Ⅱ的抗原遞呈過程，其基因的調(diào)控與慢性阻塞性肺疾病、克羅恩病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腫瘤等疾病密切相關(guān)[29]。

組織蛋白酶G在成人牙周炎的牙齦組織和齦溝液中濃度較高[30]。在牙周炎的進(jìn)程中，組織蛋白酶G在中性粒細(xì)胞中表達(dá)，可通過激活MMP-8，從而降解細(xì)胞外基質(zhì)，造成牙周組織破壞[30]。然而，Kurtulus等[31]通過免疫組織化學(xué)染色證明，組織蛋白酶G在牙齦炎和牙周炎患者中表達(dá)較低，Gul等[32]通過檢測(cè)慢性牙周炎患者酶譜發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過牙周治療后，組織蛋白酶G濃度并無特異性改變。由此可見，目前對(duì)組織蛋白酶G在牙周炎患者中的表達(dá)以及作用機(jī)制尚未達(dá)成共識(shí)。

2 組織蛋白酶抑制劑

理想的抑制劑應(yīng)具有高度選擇性，存在最小的肽單元，具有良好的生物藥效率、較高的膜通透性、較長(zhǎng)的血漿半衰期以及在溶酶體中可利用性[33]。其中，內(nèi)源性抑制劑主要有：前體肽、Cystatin家族（包括stefins、cystatins、kininogens大類）、Serpin家族、Thyropins類、α2巨球蛋白細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原-2β等；合成肽類抑制劑主要有：醛類、酮類、腈類、環(huán)氧琥珀酰類、乙烯基砜類等。組織蛋白酶抑制劑主要有減少腫瘤轉(zhuǎn)移與侵襲、降低組織膠原溶解與破壞、抑制骨基質(zhì)降解等作用，其研究為預(yù)防和控制牙周疾病、降低牙周組織的損傷提供了靶點(diǎn)，對(duì)臨床應(yīng)用具有重要指導(dǎo)意義。

2.1 組織蛋白酶K抑制劑

組織蛋白酶K的內(nèi)源性蛋白抑制劑有stefin B、cystatin C等，合成肽類抑制劑有二肽苯氧甲基酮、肽類乙烯基砜化合物等。組織蛋白酶K抑制劑對(duì)于預(yù)防和治療骨吸收具有顯著作用，通過不同靶點(diǎn)抑制組織蛋白酶K進(jìn)而防止骨吸收的藥物已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)，如抗再吸收劑雙膦酸鹽、降鈣素、雌激素和抗RANKL抗體以及促進(jìn)骨形成的甲狀旁腺激素等[34]?，F(xiàn)階段的研究熱點(diǎn)主要集中在對(duì)于腫瘤以及骨質(zhì)疏松癥的治療。

其中，雙膦酸鹽通過抑制破骨細(xì)胞活性，廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移、多發(fā)性骨髓瘤的治療，然而應(yīng)用雙膦酸鹽導(dǎo)致頜骨壞死這一不良反應(yīng)近年來得到持續(xù)關(guān)注和報(bào)道。其具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，推測(cè)可能與時(shí)間和劑量相關(guān)[34]。

Odanacatib是一種組織蛋白酶K抑制劑，作為最有前景的治療骨質(zhì)疏松癥的藥物，可以阻止組織蛋白酶K與底物結(jié)合，現(xiàn)在已進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)，然而其有誘發(fā)心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致研發(fā)遺憾終止[35]。

就目前研究進(jìn)展來看，組織蛋白酶K在牙周炎中的作用機(jī)制較明確，其抑制劑的研究對(duì)于口腔骨吸收疾病防治意義較大、前景較好。

2.2 組織蛋白酶B抑制劑

組織蛋白酶B的內(nèi)源性蛋白抑制劑有stefin A和B、cystatin C等，其中stefin A抑制力較強(qiáng)，cystatin C對(duì)于組織蛋白酶B具有較大親和力。合成肽類抑制劑有CA074和CA030、吡咯酮類物質(zhì)等[36]，其中由于CA074對(duì)組織蛋白酶B有較高的選擇性和不可逆性，現(xiàn)階段研究較為廣泛[37]。

2.3 組織蛋白酶C抑制劑

組織蛋白酶C抑制劑研發(fā)的主要挑戰(zhàn)是藥物的代謝穩(wěn)定性和體內(nèi)的半衰期。在合成不可逆抑制劑中，二肽重氮甲基酮選擇性較強(qiáng)[38]。

2.4 組織蛋白酶G抑制劑

在組織蛋白酶G抑制劑中，目前認(rèn)為b-酮膦酸衍生物、氨基烷基膦酸酯和乳香酸最具開發(fā)前景[29]。

3 總結(jié)與展望

組織蛋白酶在機(jī)體內(nèi)的調(diào)控表達(dá)對(duì)全身健康的影響具有重要意義。而在牙周疾病進(jìn)程中，組織蛋白酶K的作用機(jī)制相對(duì)較明確，其可以通過調(diào)控RANK-RANKL信號(hào)通路，經(jīng)NF-κB、NFAT途徑促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化，進(jìn)而控制牙周組織中骨組織的代謝，同時(shí)也參與牙周疾病的免疫炎癥反應(yīng)。推測(cè)組織蛋白酶B與牙周炎的關(guān)系可能與TLR2/NF-κB途徑有關(guān)，組織蛋白酶B可通過慢性活化TLR2/NF-κB通路，降解Ⅲ型和Ⅳ型膠原，造成牙周組織損傷。組織蛋白酶C與PLS密切相關(guān)，其基因突變被認(rèn)為是PLS的致病基礎(chǔ)。組織蛋白酶G也被發(fā)現(xiàn)與牙周炎有關(guān)，但作用機(jī)制尚不明確。

由于牙周炎的進(jìn)程復(fù)雜、機(jī)制多樣，難以依靠單一的生物標(biāo)志物反映牙周炎的進(jìn)展，組織蛋白酶的研究為牙周炎標(biāo)志物提供又一種可能的參考。以組織蛋白酶為標(biāo)志物，對(duì)牙周炎發(fā)生、發(fā)展的監(jiān)測(cè)有較深刻的意義，通過控制牙周組織內(nèi)的組織蛋白酶來控制牙周病的發(fā)展及牙周組織的破壞，將有望成為牙周炎防治的重要措施。因此，組織蛋白酶在體內(nèi)的具體病理及生理作用，還需進(jìn)一步研究及完善。