王霄霄 王海霞 左徳筠 黃國(guó)慶

[摘要] 代謝組學(xué)是一種通過(guò)定量描述代謝物的動(dòng)態(tài)變化來(lái)解讀被研究對(duì)象病理生理狀態(tài)的新興學(xué)科，主要分析方法為質(zhì)譜技術(shù)（MS）和核磁共振技術(shù)（NMR）。本文通過(guò)文獻(xiàn)檢索，對(duì)代謝組學(xué)研究及其常用技術(shù)的優(yōu)勢(shì)及局限性以及其在醫(yī)學(xué)研究中的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、技術(shù)操作、統(tǒng)計(jì)方法等進(jìn)行綜述，對(duì)代謝組學(xué)在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用所遇到的挑戰(zhàn)和未來(lái)的探索方向進(jìn)行討論。

[關(guān)鍵詞] 代謝組學(xué);醫(yī)學(xué);質(zhì)譜;核磁共振;進(jìn)展

[中圖分類號(hào)] R441? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2019）01-0165-04

Progress in the application of metabolomics and its analytical techniques in medical research

WANG Xiaoxiao WANG Haixia ZUO Dejun HUANG Guoqing

Department of Cardiology， Zhongshan Hospital Affiliated to Dalian University， Dalian? ?116001， China

[Abstract] Metabolomics is an emerging discipline for interpreting the pathophysiological state of the subjects by quantitatively describing the dynamic changes of metabolites. The main analytical methods are mass spectrometry（MS） and nuclear magnetic resonance（NMR）. This paper reviews the advantages and limitations of metabolomics research and its commonly used techniques， as well as its experimental design， technical operation， and statistical methods in medical research through literature search. The challenges and future directions of exploration in the application of metabolomics were discussed.

[Key words] Metabolomics; Medicine; Mass spectrometry; Nuclear magnetic resonance; Progress

代謝組學(xué)（metabolomics）研究起始于20世紀(jì)70年代至90年代，Oliver和Ferenci的研究小組分別于1997年和1998年對(duì)其進(jìn)行了首次定義[1]。在早期發(fā)展中出現(xiàn)了兩種英文形式：metabolomics和metabonomics，如今認(rèn)為兩者是同義詞并可互換使用[2，3]?，F(xiàn)在認(rèn)為，代謝組學(xué)是一種通過(guò)定量描述生物體內(nèi)多種代謝物的動(dòng)態(tài)變化來(lái)解讀被研究對(duì)象病理生理狀態(tài)的新興學(xué)科。其出現(xiàn)于基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要構(gòu)成部分[1，4]。在系統(tǒng)生物學(xué)中，基于蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)行的基因組研究更突出調(diào)控層面，在探索受環(huán)境動(dòng)態(tài)變化影響的疾病代謝表型和表型紊亂方面，代謝組學(xué)為首選研究方法（圖1）[5，6]。近十幾年來(lái)代謝組學(xué)發(fā)展迅速（封三圖5），在醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中逐漸顯現(xiàn)出它的優(yōu)勢(shì)。人們希望通過(guò)分析找出與疾病密切相關(guān)的異常代謝途徑和特征生物標(biāo)志物，為進(jìn)一步闡明疾病的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。

1 代謝組學(xué)研究方法

從研究設(shè)計(jì)的原理上來(lái)說(shuō)，代謝組學(xué)是一種相對(duì)簡(jiǎn)單的研究方法：根據(jù)已確定的代謝組學(xué)研究方法收集樣本，使用技術(shù)手段獲取代謝物，確定組間代謝物有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異并進(jìn)行進(jìn)一步分析[7]（圖2）。代謝組學(xué)研究方法有非靶向（Untargeted）代謝組學(xué)和靶向（Targeted）代謝組學(xué)兩種。非靶向代謝組學(xué)分析全部代謝物情況，不對(duì)特定代謝物做預(yù)先假設(shè)，重復(fù)性和針對(duì)性較差，通常被稱為假設(shè)生成或發(fā)現(xiàn)階段實(shí)驗(yàn)。其特點(diǎn)是產(chǎn)生大量復(fù)雜多效的數(shù)據(jù)，因此需要高性能生物分析工具，通常用于發(fā)現(xiàn)以前未知的生理模式，為發(fā)現(xiàn)新的代謝產(chǎn)物和代謝途徑提供方向，是相對(duì)開放的分析[8-10]。靶向代謝組學(xué)研究是以高精確度來(lái)驗(yàn)證先前的科學(xué)假設(shè)或可能的生物標(biāo)志物并進(jìn)行更有針對(duì)性的研究，重復(fù)性和選擇性好，也被稱為假設(shè)驅(qū)動(dòng)實(shí)驗(yàn)。其用于確定新的生物標(biāo)志物，研究代謝物的功能和途徑，進(jìn)一步揭示代謝物和疾病之間的關(guān)聯(lián)，是相對(duì)封閉的分析。靶向代謝組學(xué)在應(yīng)用上有兩點(diǎn)局限：一是可能有代謝物未被檢測(cè)到，從而減少了發(fā)現(xiàn)機(jī)會(huì);二是使用該方法前，需要進(jìn)行大量的非靶向研究資料收集[1，8-10]。

2 代謝組學(xué)主要技術(shù)

人類代謝組學(xué)包括成千上萬(wàn)已知和未知小分子代謝物，這些代謝物的極性、大小和濃度不同，范圍從低分子量的親水極性代謝物（如氨基酸）到高分子量的疏水非極性代謝物（如脂質(zhì)）。這種多樣性意味著代謝物的檢測(cè)、識(shí)別和量化在技術(shù)上極具挑戰(zhàn)性[11]。目前還沒(méi)有一種分析方法能夠檢測(cè)或量化人體樣本中所有的代謝物，人們嘗試采用多種分析技術(shù)來(lái)進(jìn)行代謝物的互補(bǔ)覆蓋分析，其中核磁共振技術(shù)（Nuclear magnetic resonance，NMR）和質(zhì)譜技術(shù)（Mass spectrometry，MS）是應(yīng)用最廣泛的方法[9， 12]。

2.1核磁共振（NMR）技術(shù)

NMR技術(shù)是一種利用不同原子核吸收輻射產(chǎn)生不同共振頻率，將這些共振頻率轉(zhuǎn)化為分子化學(xué)和結(jié)構(gòu)信息的光譜技術(shù)[13]。施加入磁場(chǎng)的靶向原子核不同，產(chǎn)生的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)也不同。氫是最常見的靶向原子核（1H-NMR），其他原子如碳（13C-NMR）和磷（31P-NMR）等也可通過(guò)NMR技術(shù)得到特定代謝物類型的信息[14]。目前以1H-NMR光譜、2H-NMR光譜、高分辨率魔角旋轉(zhuǎn)（HRMAS-NMR）光譜等常見。多年實(shí)踐證明1H-NMR光譜分析結(jié)果中復(fù)雜的代謝譜導(dǎo)致信號(hào)重疊，使得低豐度代謝物被具有相似或相同化學(xué)位移的高豐度代謝物掩蓋。這個(gè)問(wèn)題可以通過(guò)應(yīng)用2H-NMR或3H-NMR光譜加以改善和克服[9，15]。此外，高分辨率魔角旋轉(zhuǎn)（HRMAS-NMR）光譜可用于完整組織的代謝譜分析，無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行任何預(yù)處理，已用于研究包括腦、腎、肝臟等組織在內(nèi)的小型完整組織樣品的代謝組學(xué)分析[12，16]。NMR光譜不需要色譜處理，樣品制作簡(jiǎn)單并可重復(fù)多次使用，是一種快速、高效的非靶向分析技術(shù)方法，適合代謝物的定性和定量研究[7，9，15]。目前已被廣泛應(yīng)用于生物結(jié)構(gòu)、生物學(xué)、生物化學(xué)等眾多領(lǐng)域，是代謝組學(xué)主要的分析方法之一。但低靈敏度一直是NMR光譜分析的固有缺點(diǎn)，也是其在生物醫(yī)學(xué)研究應(yīng)用中的挑戰(zhàn)。近年來(lái)，高磁場(chǎng)磁體、脈沖序列和冷凍探針技術(shù)[12]的技術(shù)進(jìn)步使得NMR實(shí)驗(yàn)的靈敏度和分辨率得到了明顯提高。

2.2質(zhì)譜（MS）

MS分析是利用電場(chǎng)和磁場(chǎng)將運(yùn)動(dòng)的離子按質(zhì)荷比（m/z）分離并進(jìn)行檢測(cè)的方法[10]。在科研實(shí)驗(yàn)中，未結(jié)合色譜的MS方法有直接輸注質(zhì)譜法（DI-MS）和流動(dòng)注射質(zhì)譜法（FI-MS）兩種。DI-MS分析將樣品直接引入質(zhì)譜儀進(jìn)行連續(xù)電離。FI-MS分析是把樣品注入連續(xù)的有機(jī)相流中，以100～1000 mL/min的速率流入電噴霧界面，允許每小時(shí)注射50～100個(gè)樣品[1，5]。此處需明確兩個(gè)概念：一是基質(zhì)效應(yīng)：在MS方法中，樣品中的其他化合物或外部來(lái)源的容器（如塑料、緩沖液、固定相等）的存在是一種“基質(zhì)”，其降低了特定化合物被電離的能力[17]。二是離子抑制效應(yīng)：由于存在另一種共洗脫離子而導(dǎo)致特定離子MS信號(hào)的改變[18]。在DI-MS和FI-MS的實(shí)際應(yīng)用中，代謝物樣本和基質(zhì)的共洗脫增加了樣品復(fù)雜性，使得分析的分辨率和靈敏度下降。為了解決這個(gè)問(wèn)題，基于MS的代謝組學(xué)通常聯(lián)合色譜進(jìn)行色譜分離，減少基質(zhì)效應(yīng)和離子抑制效應(yīng)[5，18]。目前MS聯(lián)用色譜可分為液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（liquid chromatography-MS，LC-MS）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）以及毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（capillary electrophoresis-MS，CE-MS）三類。不同色譜分離方法的選擇取決于分析物的性質(zhì)（如分子量和親水性/疏水性）：LC-MS主要用于在溶液中不揮發(fā)的化合物，GC-MS主要用于揮發(fā)性及低沸點(diǎn)化合物。分離后的分析物在進(jìn)入MS儀器前必須被電離，電離方法和MS檢測(cè)器類型相關(guān)[10]。

LC-MS包含兩種功能強(qiáng)大的分析工具：高效液相色譜（HPLC）和MS。LC-MS具有高靈敏度、高分辨率優(yōu)勢(shì)，能夠檢測(cè)到更多（200～500）的代謝物，可能是目前使用最廣泛的質(zhì)譜技術(shù)。在LC-MS中，幾種類型的常壓電離方法用于不同類別的代謝物的電離：最常用的電噴霧電離用于未知代謝物的初步篩選，大氣壓化學(xué)電離和大氣壓光電離適用于非極性代謝物的檢測(cè)，并已被廣泛應(yīng)用于脂質(zhì)組學(xué)研究[9，19]。GC-MS的優(yōu)勢(shì)包括高分離效率和良好的靈敏度。在使用GC-MS時(shí)應(yīng)注意，數(shù)據(jù)采集之前需要進(jìn)行樣品衍生化來(lái)降低代謝物的極性，增加熱穩(wěn)定性和揮發(fā)性[1]。但GC-MS只能檢測(cè)揮發(fā)性的或可被衍生化的揮發(fā)性化合物，有些不能被電離的代謝物無(wú)法檢測(cè)到?，F(xiàn)代MS儀器有離子阱、飛行時(shí)間、軌道阱和四極桿及傅里葉變換等類型。同NMR光譜相比，MS法的高靈敏度和高分辨率使檢測(cè)大動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)數(shù)千種代謝物成為現(xiàn)實(shí)，讓MS成為需要低豐度代謝物數(shù)據(jù)或同時(shí)分離大量代謝物的研究人員的首選方法[1，5，9]。

NMR和MS均具有明顯的優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)（表1），具有很強(qiáng)的互補(bǔ)性，這兩種技術(shù)結(jié)合可以提高研究的總體質(zhì)量。近幾年來(lái)，研究者們開始聯(lián)合應(yīng)用NMR和MS進(jìn)行樣本代謝譜分析、藥物功效及毒理、疾病病理生理學(xué)各方面的研究[20-22]，并對(duì)NMR和MS分析平臺(tái)的兼容性展開了探索[7]。

3 樣本的采集和預(yù)處理

可用于代謝組學(xué)分析的樣本有血液、尿液、腦脊液、唾液、活檢組織提取物或細(xì)胞提取物（原代培養(yǎng)物）等。樣本來(lái)源的選擇取決于研究目標(biāo)、樣本可用性以及使用的分析平臺(tái)。血液以及尿液是人類代謝組學(xué)研究中最常用的樣本。在樣品采集過(guò)程中，血液樣本需要合適的含抗凝劑（鋰肝素、EDTA和檸檬酸鉀）的收集管，在分析前需要在4℃環(huán)境下分離血清或血漿、去除蛋白質(zhì)等，這可能是血液代謝組學(xué)研究中預(yù)分析誤差的主要來(lái)源之一[15]。目前普遍認(rèn)為血液樣品采集到細(xì)胞分離的最長(zhǎng)間隔時(shí)間不超過(guò)35 min，因?yàn)檠娱L(zhǎng)等待時(shí)間可能會(huì)使血細(xì)胞中葡萄糖代謝持續(xù)，增加乳酸水平;此外，在實(shí)驗(yàn)中還應(yīng)避免反復(fù)的凍融步驟[23]。與血液樣本相比，尿液樣本的生物組成相對(duì)簡(jiǎn)單，蛋白質(zhì)含量較低，通常不需要額外的代謝物提取步驟（尿蛋白異常的病患標(biāo)本除外），但尿液樣本中的高尿素水平可能損傷分析儀器。傳統(tǒng)的組織分析也需要大量的代謝物提?。ㄈ缂?xì)胞壁的均質(zhì)化和溶解以釋放代謝物），但受益于NMR技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在人們可以利用HRMAS-NMR直接對(duì)組織樣本進(jìn)行分析而不需要預(yù)處理。

4 數(shù)據(jù)預(yù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

在獲取代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析之前，通常必須對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，主要包括信號(hào)校正和標(biāo)準(zhǔn)化兩個(gè)方面[1，15]。信號(hào)校正用來(lái)減少數(shù)據(jù)集已知或未知偏倚的影響，如正交信號(hào)校正（OSC）。數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化包括數(shù)據(jù)縮放或轉(zhuǎn)換、計(jì)算缺少值、檢測(cè)并刪除異常值等[1]。許多技術(shù)問(wèn)題可能會(huì)引起代謝組學(xué)研究的系統(tǒng)性誤差，這些主要涉及MS，而核磁共振的一個(gè)很大優(yōu)勢(shì)就是分析的相對(duì)穩(wěn)健性和重復(fù)性。

在醫(yī)學(xué)代謝組學(xué)研究中，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通常與年齡、性別、飲食、運(yùn)動(dòng)等多個(gè)變量相關(guān)，變量統(tǒng)計(jì)方法能夠處理這些參數(shù)數(shù)據(jù)。根據(jù)變量可分為單變量分析和多變量分析。單變量分析方法包括t檢驗(yàn)、Wilcoxon秩和檢驗(yàn)以及方差分析（ANOVA）等方法。多變量分析方法分為無(wú)監(jiān)督法和有監(jiān)督法[7，24，25]兩大類，無(wú)監(jiān)督法通常用于識(shí)別整體趨勢(shì)，不考慮研究樣本的類型，包括廣泛使用的主成分分析（PCA）、方差分析同步成分分析（ASCA）、層次聚類分析（HCA）等;有監(jiān)督方法根據(jù)分析前表型對(duì)研究樣本進(jìn)行分類，人為加入分組變量，正確反映因變量與自變量之間的相關(guān)性，更適合構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型[8]，包括偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）、偏最小二乘法（PLS）回歸、正交偏最小二乘法（OPLS）、軟獨(dú)立建模分類法（SIMCA）等。目前醫(yī)學(xué)代謝組學(xué)研究中的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法以主成分分析（PCA）和偏最小二乘判別分析（PLS-DA）使用最為廣泛。

5總結(jié)

代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)的重要部分已滲透到眾多領(lǐng)域，廣泛應(yīng)用于包括藥物研發(fā)、疾病診斷、營(yíng)養(yǎng)學(xué)、個(gè)性化醫(yī)療和環(huán)境研究等與人類疾病密切相關(guān)的領(lǐng)域[1，7，9，26]。目前代謝組學(xué)在發(fā)展中顯露出幾個(gè)需要克服的方面：一是代謝產(chǎn)物化學(xué)鑒定：目前我們進(jìn)行代謝物均是通過(guò)與真實(shí)的化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較來(lái)鑒定的，但目前所有可能的代謝物都不能在市場(chǎng)上買到，或者購(gòu)買成本很高;二是標(biāo)準(zhǔn)化：全世界估計(jì)有超過(guò)200個(gè)實(shí)驗(yàn)室[1]進(jìn)行代謝組學(xué)研究，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)最佳的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、分析實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析工具均有不同的觀點(diǎn)。在可預(yù)見的未來(lái)，堅(jiān)持標(biāo)準(zhǔn)化方法和工具的能力在代謝組學(xué)中被接受的可能性不大;三是集成數(shù)據(jù)集：系統(tǒng)生物學(xué)的成功將取決于來(lái)自不同來(lái)源的數(shù)據(jù)的整合和分析，包括高通量的組學(xué)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)。分享和傳播方法和結(jié)果的能力是至關(guān)重要的，適當(dāng)?shù)膱?bào)告標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于成功傳播數(shù)據(jù)也是非常必要的，我們還需要重大的推動(dòng)力來(lái)展開知識(shí)的傳遞與交流，加快合作。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Dunn WB，Broadhurst DI，Atherton HJ，et al. Systems level studies of mammalian metabolomes：the roles of mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy[J]. Chem Soc Rev，2011，40（1）：387-426.

[2] Nicholson JK，Lindon JC. Systems biology：Metabonomics[J].Nature，2008，455（7216）： 1054-1056.

[3] Dudley E，Yousef M，Wang Y，et al. Targeted metabolomics and mass spectrometry[J]. Adv Protein Chem Struct Biol，2010，80：45-83.

[4] 劉佳梅，劉佳，蔡軍，等. 原發(fā)性高血壓相關(guān)代謝組學(xué)的初步研究[J]. 中華高血壓雜志，2016，24（4）：340-347.

[5] Fuhrer T，Zamboni N. High-throughput discovery meta-bolomics[J]. Curr Opin Biotechnol， 2015，31：73-78.

[6] Jacob M，Lopata AL，Dasouki M，et al. Metabolomics toward personalized medicine[J]. Mass Spectrom Rev，2017.

[7] Marshall DD，Powers R. Beyond the paradigm：Combining mass spectrometry and nuclear magnetic resonance for metabolomics[J]. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc，2017，100：1-16.

[8] Alonso A，Marsal S，Julia A. Analytical methods in untargeted metabolomics：state of the art in 2015[J]. Front Bioeng Biotechnol，2015，3（23）：1-20.

[9] Au A，Cheng KK，Wei LK. Metabolomics，Lipidomics and Pharmacometabolomics of Human Hypertension[J]. Advances in Experimental Medicine and Biology，2017，2：599-613.

[10] Sofia Tsiropoulou MM，Sandosh Padmanabhan.Urine Meta-bolomics in Hypertension Research[J]. Methods in Mo-lecular Biology，2017，1527：61-68.

[11] Wishart DS，F(xiàn)eunang YD，Marcu A，et al. HMDB 4.0：the human metabolome database for 2018[J]. Nucleic Acids Research，2018，4（46）：608-617.

[12] Emwas AH. The strengths and weaknesses of NMR spectroscopy and mass spectrometry with particular focus on metabolomics research[J]. Methods Mol Biol，2015，1277：161-193.

[13] John HF，Bothwell，Griffin JL. An introduction to biological nuclear magnetic resonance spectroscopy[J]. Biological Reviews，2011，86（2）：493-510.

[14] NV R. NMR-based metabolomics[J]. Drug and Chemical Toxicology，2002，25（4）：375-382.

[15] Nikolic SB，Sharman JE，Adams MJ，et al. Metabolomics in hypertension[J]. J Hypertens，2014，32（6）：1159-1169.

[16] Beckonert O，Coen M，Keun HC，et al. High-resolution magic-angle-spinning NMR spectroscopy for metabolic profiling of intact tissues[J]. Nature Protocols，2010，5（6）： 1019-1032.

[17] Antignac JP，De Wasch K，Monteau F，et al. The ion suppression phenomenon in liquid chromatography-mass spectrometry and its consequences in the field of residue analysis[J]. Analytica Chimica Acta，2005，529（1-2）：129-136.

[18] Patti GJ. Separation strategies for untargeted metabolo-mics[J]. J Sep Sci，2011，34（24）：3460-3469.

[19] Xiao JF，Zhou B，Ressom HW. Metabolite identification and quantitation in LC-MS/MS-based metabolomics[J]. Trends in analytical chemistry：TRAC，2012，1（32）：1-14.

[20] Wu C，Chen CH，Chen HC，et al. Nuclear magnetic resonance-and mass spectrometry-based metabolomics to study maleic acid toxicity from repeated dose exposure in rats[J]. Journal of Applied Toxicology：JAT，2017，37（12）：1493-1506.

[21] Gil AM，Duarte D. Biofluid Metabolomics in Preterm Birth Research[J]. Reproductive sciences（Thousand Oaks，Calif），2018，25（7）：967-977.

[22] Cala MP，Aldana J，Medina J，et al. Multiplatform plasma metabolic and lipid fingerprinting of breast cancer：A pilot control-case study in Colombian Hispanic women[J]. PLoS One， 2018，13（2）：1-23.

[23] Yin P，Lehmann R，Xu G. Effects of pre-analytical processes on blood samples used in metabolomics studies[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry，2015，407（17）：4879-4892.

[24] Bartel J，Krumsiek J，Theis FJ. Statistical methods for the analysis of high-throughput metabolomics data[J]. Comput Struct Biotechnol J，2013，4（5）：1-9.

[25] 周寧，顏賢忠. 代謝性疾病的代謝組學(xué)研究進(jìn)展[J]. 國(guó)際藥學(xué)研究雜志，2015，42（5）： 561-573.

[26] Astarita G，Langridge J. An emerging role for metabolomics in nutrition science[J]. Journal of Nutrigenetics and Nutrigenomics，2013，6（4-5）：181-200.