淺析透射電子顯微鏡在生物學科中的應用①

李 葉 黃華平 張新春 崔艷梅 鄧 睿 林培群

(1 中國熱帶農業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所 海南海口571101;

2 農業(yè)部熱帶農林有害生物入侵監(jiān)測與控制重點開放實驗室 海南儋州571737)

透射電子顯微鏡（Transmission electron microscopy，TEM），以下簡稱透射電鏡，是以波長極短的電子束作為照明源，用電磁透鏡聚焦成像的一種高分辨、高放大倍數(shù)的電子光學儀器，被廣泛應用于材料、醫(yī)學、生命科學等研究領域。它按加速電壓分為低壓透射電鏡（＜120 Kv），高壓透射電鏡（200～400 Kv）和超高壓透射電鏡（＞400 Kv）；按照明系統(tǒng)分為普通透射電鏡和場發(fā)射透射電鏡；按成像系統(tǒng)分為低分辨率和高分辨率。目前主要商品透射電子顯微鏡生產廠家包括日本日立（Hitachi）公司、日本電子（JEM）公司、荷蘭菲律普（Philips）公司、德國西門子（Siemens）公司、英國聯(lián)合（AEI）電氣公司等，高性能多用途的透射電鏡也不斷更新，如掃描透射電鏡、分析電鏡、場發(fā)射電鏡、超高壓電鏡、球差校正電鏡、光電聯(lián)用電鏡、冷凍電鏡、原子力顯微鏡等。

人類對于生物結構，最初只能在肉眼觀察所及的范圍內建立起早期的形態(tài)研究。17 世紀光學顯微鏡的發(fā)明，使人們看到了細胞和細菌的形態(tài)結構，并促進了細胞學的建立和發(fā)展，使人類對生物微觀世界的認識發(fā)生了一次飛躍。20 世紀30年代，科學家在光學顯微鏡的基礎上研制出了電子顯微鏡，使人類充分認識到物質世界的本質和奧妙，明白了結構與功能的相互關系。近年來，隨著科學技術和生產實踐的發(fā)展，電子顯微鏡在結構、功能和電子顯微技術方面得到不斷改進、更新和完善，電鏡觀察的分辨率可達0.20 nm。電子顯微成像技術將人們對生物體細胞結構的觀察推到亞細胞水平，可直接觀察到生物細胞內各種細胞器和膜系統(tǒng)、病毒粒子及大分子物質的形態(tài)結構。這不僅豐富了人們對微觀世界的認識，也大大推動了生物學中許多科研領域的發(fā)展，且透射電鏡的自動化程度也不斷提高，操作界面越來越簡單，使透射電鏡成為研究生物組織、細胞及細胞器超微結構觀察的重要工具之一，在生物科學研究中發(fā)揮了極為重要的作用。本文以中國熱帶農業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所的日立HT-7700 型透射電鏡為例，介紹透射電鏡的成像原理、生物樣品制備以及在生物學科中的應用，以期為電鏡初學者及農業(yè)科技工作者提供參考。

1 透射電鏡的成像原理

透射電鏡成像是通過電子槍發(fā)出高速電子束經(jīng)1～2 級聚光鏡會聚后均勻照射到樣品的某一待觀察微小區(qū)上，入射電子與樣品會發(fā)生碰撞與非碰撞，由于樣品很?。娮拥拇┩改芰苋?，因此樣品必須很?。蟛糠蛛娮哟┩笜悠?，其強度分布與所觀察樣品區(qū)的形貌、組織、結構一一對應。投射出樣品的電子經(jīng)過物鏡、中間鏡和投影鏡的三級磁透鏡放大投射在觀察圖像的熒光屏上，熒光屏把電子強度分布轉化為人眼可見的光強分布，于是在熒光屏上顯出與樣品形貌、組織、結構相應的圖像以供使用者觀察［1]。透射電鏡光路與成像見圖1。

2 透射電鏡生物樣本的制備

透射電鏡應用于生物樣本式樣分析，樣品制備技術是準確觀察細胞內外超微結構的關鍵控制因素。生物樣本的電鏡制備技術復雜、繁瑣，環(huán)節(jié)很多，往往一環(huán)失敗都有全局皆敗的可能，如生物樣品制備技術出了問題，會造成各種形態(tài)假象，影響觀察結果的診斷［2]。因此必須了解每一技術環(huán)節(jié)的原理，嚴格按實驗流程操作才能得到高質量的電鏡結果。

圖1 透射電鏡光路與成像示意圖

超薄切片技術已成為最基本、最通用的透射電鏡生物樣本制備技術。其制樣過程主要包括以下步驟：取材、固定、清洗、脫水、浸透、包埋、超薄切片、染色等過程。在進行具體生物樣本的透射電鏡樣品制備過程中，需要考察不同樣品的結構、化學成分及水分含量等信息，結合生物樣本高度非均勻性的特點，優(yōu)化合理的制樣方法，盡可能減少樣品前處理步驟，減少外源化學物對樣本組織的干擾，避免造成了假象。

3 透射電鏡在生物學科中的應用

3.1 在植物學研究中的應用

應用透射電鏡觀察植物組織的超微結構，研究器官的形態(tài)發(fā)育過程中內部結構變化，觀察其組織分化、生長發(fā)育過程，探討其形態(tài)結構變化的機理及其結構發(fā)育，揭示植物結構與功能關系，為改善植物功能和提高植物產量提供理論依據(jù)；應用透射電鏡技術比較同一種植物或不同中植物生長在不同生態(tài)條件下其內部的超微結構變化的規(guī)律，觀察其探索植物的結構及形成過程與生長環(huán)境的相互關系，為經(jīng)濟作物提高栽培技術提供依據(jù)。

吳凱等［3]綜述了逆境（如鹽漬、干旱、低溫、重金屬等）作用對植物細胞超微結構的損傷效應，探討植物受環(huán)境脅迫后其細胞超微結構的變化規(guī)律，為植物的受損機理以及抗逆研究提供細胞學證據(jù)。

王寧［4]對樟樹、楊鳳仙［5]對棉花、周蘊薇［6]對翠南報春及葛秀秀等［7]對幾種植物的抗寒性研究發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫過程中，植物葉肉細胞中葉綠體的結構首先發(fā)生變化，為北方地區(qū)耐寒植物的引種提供理論依據(jù)。陳健輝等［8]利用透射電鏡對不同耐旱性大麥品種在干旱脅迫下，比較葉片細胞中葉綠體等細胞器超微結構的變化規(guī)律，揭示了不同耐旱性大麥品種在形態(tài)結構上的特性，為大麥品種的選育提供理論參考。龔明等［9]利用透射電鏡技術研究了耐鹽的大麥和不耐鹽的小麥幼苗在NoCI 脅迫下葉片脂質過氧化作用、膜系統(tǒng)傷害、葉肉細胞超微結構變化三者之間的關系。徐麗萍等［10]運用電鏡技術對東京野茉莉雌雄芯花粉、胚珠的珠被細胞超微結構進行觀察研究，發(fā)現(xiàn)良好的的花粉細胞內細胞質濃厚，含有高爾基體，大量的線粒體，較多的高電子致密物質，淀粉粒等物質，而敗育的花粉、內部物質和結構松散，里面有些大的空泡，花粉壁外壁突起，內壁也相對薄。沈顯生等［11]利用透射電鏡對長?？嗖莸幕ǚ圻M行超微觀察，研究苦草植物的形態(tài)結構、花粉萌發(fā)機理，胚胎發(fā)育過程，中間親緣關系，為開發(fā)利用資源植物。

花生葉片在受高濃度NACL 脅迫后，葉綠體的基粒片層和基粒類囊體排列打破原有的秩序發(fā)生紊亂，失去原有整齊有序葉綠體長軸方向平行排列的狀態(tài)，部分類囊體開始解體，甚至不存在（圖2-b 箭頭所示）；在低濃度NACL 脅迫后，葉綠體多呈長橢圓形或梭形靠近質膜分布于細胞質中，片層豐富整齊，結構層次分明。基粒片層及其上基粒內囊體較整齊有序沿葉綠體長軸方向平行排列，基粒內囊體和基質片層具有完整清晰的膜系統(tǒng)，排列有序（圖2-a 箭頭所示）。檳榔病葉的超微結構觀察結果顯示：葉綠體從原來的規(guī)則梭形膨脹扭曲變?yōu)榻驙睿饽ひ淹耆?，基粒片層和基粒類囊體排列打破原有的秩序發(fā)生紊亂，失去原有整齊有序葉綠體長軸方向平行排列的狀態(tài)，較多基粒出現(xiàn)彎曲、膨脹（圖3 箭頭所示）；線粒體外膜輪廓清晰完整，但內部嵴消失不見，出現(xiàn)空洞現(xiàn)象（圖3 箭頭所示）。利用透射電鏡技術研究荔枝不同時期體胚發(fā)育的過程發(fā)現(xiàn)，早期子葉細胞內含物較豐富，細胞核較多，細胞代謝活躍（圖4-a）；成熟期子葉胚細胞形狀規(guī)則，液泡增多，細胞壁厚，細胞核大并可見核仁（圖4-b）。

圖2 不同NACL處理濃度對花生幼苗葉片細胞超微結構的影響

圖3 檳榔病葉超微結構觀察示例。

圖4 透射電鏡技術研究荔枝不同時期體胚發(fā)育的過程

3.2 昆蟲學研究中的應用

應用透射電鏡觀察昆蟲的器官和組織超微形態(tài)，研究昆蟲超微結構與生理功能的關系，觸角感覺器的種類，分布和生理功能，提高對其微小器官的辨別能力、提高分類水平，同時進一步分析器官的作用，對昆蟲的外部形態(tài)進行特征描述和比較，研究其形狀變化及其規(guī)律和結構的特征，從而加深理解它們在生理功能上的作用，為探索各種生命現(xiàn)象和生活規(guī)律提供依據(jù)，并為防治和消滅蟲害，提供理論依據(jù)。

陳慶霄等［12]透射電子顯微鏡技術觀察了蝎蛉科（Panorpidae）大雙角蝎蛉［Dicerapa nor‐pamagna（Chou）]幼蟲復眼的超微結構，并依據(jù)其結構特征推測長翅目幼蟲獨有的復眼很可能是全變態(tài)類昆蟲的祖征，其他全變態(tài)類幼蟲的側單眼可能是由復眼演化來，為探討長翅目幼蟲復眼與其他全變態(tài)類幼蟲側單眼之間的進化關系提供依據(jù)。馬菲等［13]利用掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡對舞毒蛾［Lymantria dispar（L.）]成蟲觸角感器的形態(tài)結構特征進行了觀察。結果表明，舞毒蛾雌、雄蛾觸角上均存在4種感器，即毛形感器、錐形感器、腔錐形感器、刺形感器，其中毛形感器最發(fā)達。郭付振等［14]應用掃描與透射電子顯微鏡，對美棘薊馬成蟲復眼的外部形態(tài)和內部超微結構進行觀察。成蟲復眼類型屬于并列像眼，每個小眼由1個疊層的角膜、1個真晶錐體、8個視網(wǎng)膜細胞、1對初級色素細胞、數(shù)個次級色素細胞和基膜組成，晶體周圍、視網(wǎng)膜色素細胞內和基膜處均含有豐富的色素顆粒。圖5為薊馬復眼橫切面超微結構示例；圖6為瓢蟲復眼橫切面超微結構示例；圖7 為薊馬觸角超微結構 示例。

圖5 薊馬復眼橫切面超微結構

圖6 瓢蟲復眼橫切面超微結構

圖7 薊馬觸角超微結構

3.3 在微生物學研究中的應用

應用透射電鏡觀察研究細菌、支原體等微生物的超微結構形態(tài)，研究病毒的結構和生長發(fā)育，也為新病毒、類病毒的發(fā)現(xiàn)和辨別提供科研手段；研究真菌、放線菌、細菌等的結構形態(tài)，對其分類，判別科屬和判斷病源等都有著重要意義，尤其對病菌的活動、孢子發(fā)芽、侵入寄主的方式等，均能獲得較好的效果。

Ehrilch［15]通過反復觀察小麥稈銹菌菌絲、吸器母細胞、吸器的結構，初步確定了銹菌微觀結構的基本模式；Lessie［16]等、Berlin 等［17]觀察發(fā)現(xiàn)，不同類型鞭毛菌的游動孢子在形態(tài)、細胞器的分布、鞭毛的著生位點方面存在明顯差異，鞭毛中的微管排列以“9＋2”式為其結構特征；Littlefield［18-19]等首次描述了銹菌吸器的發(fā)育過程，并發(fā)現(xiàn)吸器在寄主細胞內的形成并未刺破寄主細胞質膜進入寄主原生質內，而是被下凹的寄主質膜將吸器與寄主原生質所隔開；李正男［20]采用透射電鏡技術研究了感病植株組織內植原體粒子分布和粒子形態(tài)；胡清波等［21]借助透射電鏡超微結構觀察，揭示了柿樹葉柄被炭疽病菌侵入的過程，為探索炭疽菌柿樹的作用機理提供了新的觀測視角；謝念銘等［22]在用電鏡系統(tǒng)地觀察大量的細菌超薄切片標本中，偶然發(fā)現(xiàn)了霍亂弧菌的多層外膜泡，鉤端螺旋體的各種球狀體，以及支原體的細胞內出芽；李赤等［23]使用香蕉枯萎病菌4 號小種粗毒素和純品鐮刀菌酸對新北蕉（耐病品種）和巴西蕉（感病品種）幼苗葉片進行處理，觀察葉片超微結構發(fā)生的變化，證明了香蕉枯萎病菌的粗毒素中主要成分是鐮刀菌酸；伏波等［24]通過電鏡技術，研究測定了分離自小麥根部的植物內生枯草芽孢桿菌Em7 菌液對葡萄灰霉病菌［Botrytis cinereaPers.]的抑制作用及抑菌機理。

圖8為細菌透射電鏡觀察結果示例。霜疫霉菌受蘋果多酚處理后，細胞器內含物減少，大液泡被分隔成許多小液泡且數(shù)量增多與擠壓變形（圖9）；尖孢鐮刀菌經(jīng)揮發(fā)性的抑菌物質作用，細胞結構變形，細胞質體模糊（圖10）。經(jīng)藥效處理后膠孢炭疽菌，細胞壁受損嚴重，線粒體膨脹，出現(xiàn)空泡化（圖11）。圖12中的左圖為炭疽菌侵入寄主細胞，右圖為炭疽菌在寄主細胞內定植。

圖8 細菌透射電鏡觀察結果示例

圖9 受蘋果多酚處理后的霜疫霉菌超微結構變化

圖10 尖孢鐮刀菌經(jīng)揮發(fā)性的抑菌物質作用后地變化

3.4 在病理學研究的應用

應用透射電鏡對動、植物，昆蟲的細胞，組織和器官的超微結構病變進行研究，可為防治提供科學依據(jù)。在病理電鏡診斷方面，其具有直觀、快速、可靠的特點，在動、植物病蟲害防治中具有非常重要的作用。尤其在植物病毒、植原體等研究方面，透射電鏡具有不可替代的作用，可以通過電鏡技術，研究病毒的形態(tài)結構，基因組織結構及功能、病毒復制過程、病毒與寄主之產間的關系，觀察細胞超微結構病變，為揭示病毒的本質最終解決病毒、病害問題奠定基礎［25-26]。如在柑桔黃龍病的研究上，已通過電鏡技術，研究清楚了黃龍病的病原及其侵染途徑，為黃龍病的防治提供了科學依據(jù)［27-29]。研究戰(zhàn)略物資橡膠樹的死皮病，檳榔黃化病等成因、致病機理等具有關鍵性作用。洪鍵等［30]研究了煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、番茄花葉病毒等30 余種植物病毒的形態(tài)結構及寄主細胞超微病變。圖13 為不同形態(tài)病毒超微結構示例。

圖11 經(jīng)藥效處理后膠孢炭疽菌細胞變化（箭頭所示）

3.5 在土壤學研究中的應用

應用透射電鏡直接觀察土壤中粘土礦物形狀、大小，土壤腐殖質粘土礦物的復合情況以及膠膜的膠質情況。電鏡結合超薄切片技術，研究環(huán)境脅迫下微生物的形態(tài)特征變化、微生物與土壤固相組分的作用、微生物與微生物之間交互作用的超微結構特征；揭示土壤微生物與污染物的作用機制，跟蹤環(huán)境污染物的轉化和遷移特征；通過對植物細胞超微結構的觀察，了解環(huán)境的污染情況以及污染物對生物體形成的影響機制，為保護人類的生存空間提供理論依據(jù)。

柳檢等［31]通過TEM 觀察了芹菜根細胞內Pb 的分布特征和植物體內Pb 形態(tài)轉化過程，揭示了可食用蔬菜與Pb 作用的細胞機制及Pb 的吸收和轉運過程，為準確評估食用蔬菜的健康風險提供了理論支撐。徐信蘭等［32]對受不同污染梯度的幾種植物葉片的電鏡觀察表明，重金屬污染給植物細胞帶來傷害，表現(xiàn)在細胞發(fā)生質壁分離，葉綠體、類囊體腫脹，片層結構不清楚或消失，這些變化直接影響植物的光合作用，對其生長發(fā)育帶來不良影響；在細胞壁、葉泡膜上有重金屬沉淀，這是植物耐重金屬的一種機制。

3.6 在環(huán)境科學研究中的應用

圖12 炭疽菌侵入寄主細胞（箭頭所示）（左圖） 及在寄主細胞內定植（箭頭所示）（右圖）

應用透射電鏡觀察大氣粒子的形態(tài)結構，測定粒子的大小，對粒子所含成分進行檢測，可以在微粒水平上得到有關大氣粒子的知識，進而理解它們在環(huán)境中所起的作用，從而為探索各種大氣環(huán)境問題的形成條件和機制提供重要的證據(jù)。Qian 等［33]利用復合薄膜法已能夠檢出粒子中所含的SO4-2和NO3-離子。錢公望［34]利用透射電鏡技術，對中國廣州的大氣污染、南極粒子、日本山地的酸霧進行了初步觀察。結果表明通過電子顯微鏡的微觀分析，可以得到有關大氣粒子詳細的知識，進而理解它們在環(huán)境中所起的作用。

圖13 不同形態(tài)病毒超微結構（經(jīng)2%磷鎢酸負染色）

4 結論與展望

透射電鏡不能像光學顯微鏡一樣，直接觀察活體樣品及經(jīng)某些簡單的方法制得的樣品厚切片，它需對生物樣品進行固定、漂洗、脫水、浸透、包埋、聚合、切片及染色等處理。由于步驟繁瑣，操作復雜，生物組織和和細胞結構形態(tài)很可能發(fā)生某些變化。因此，在用透射電子顯微鏡觀察生物樣品前必須適當處理，根據(jù)實驗材料尋找合適的處理條件，使樣品損失程度最小，以求獲得較好的、較真實的觀察結果［2]。在過去幾十年中，為了使生物樣品在處理過程中盡可能保持其自然形態(tài)與結構，以及其中的固有成分，技術人員不僅對電鏡的結構進行了改進，還研制出了一些高性能的電子顯微鏡。此外，科技人員及電鏡工作者還對生物樣品的處理方法進行了不斷的摸索，使其方法日趨完善。除目前廣泛使用的戊二醛—鋨酸雙重固定方法外，一些新的技術與方法，如超低溫冷凍置換固定技術、冰凍蝕刻技術、低溫干燥技術及低溫包埋技術等也已相續(xù)用于生物樣品的處理。

近年來，電鏡技術在生物中的應用已超越了單純形態(tài)結構研究的范疇，與免疫學、細胞化學、放射性同位素標記等技術相結合，形成了免疫電鏡技術、電鏡細胞化學技術、放射自顯影技術等，用于研究細胞內特定蛋白質、糖類等物質的定位與探索這些物質在細胞中的合成、轉移以及其生理功能。將靜止的形態(tài)學觀察與動態(tài)生理功能研究相結合的新型電鏡技術為生物學提供了新的方法與途徑［35]。隨著多功能電鏡（包括超高壓電鏡）的更新?lián)Q代和電子顯微技術的發(fā)展以及制樣方法的不斷改進和完善，電子顯微鏡在生物科學研究中并將發(fā)揮更大的作用。