慢性束縛應(yīng)激大鼠下丘腦弓狀核食欲調(diào)控因子的變化*

王 霞，王少賢△，方朝義，王杰鵬，曠湘楠，趙 丹，王一旭

(1河北中醫(yī)學(xué)院中醫(yī)診斷教研室， 2河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治重點實驗室， 河北 石家莊 050200)

伴隨著社會競爭日益激烈和生活節(jié)奏不斷加快，緊張的工作環(huán)境、復(fù)雜的人際關(guān)系和沉重的經(jīng)濟壓力等長期、慢性心理應(yīng)激已成為威脅人類健康的重要因素。機體體重增長緩慢和飲食量下降，則是常見的慢性應(yīng)激反應(yīng)。本研究動態(tài)觀察了慢性束縛應(yīng)激大鼠攝食量及體重變化，并采用ELISA、Western blot和RT-qPCR方法分別測定其血清瘦素(leptin)水平及下丘腦弓狀核(arcuate nucleus，ARC)中食欲調(diào)控因子瘦素受體(leptin receptor，LEPR)、神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y，NPY)、刺鼠相關(guān)蛋白(agouti-related protein，AgRP)、阿黑皮素原(proopiomelanocortin，POMC)和可卡因苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄物(cocaine amphetamine-regulated transcript，CART)的表達情況，以探討應(yīng)激狀態(tài)下機體出現(xiàn)攝食和能量代謝異常的中樞機制。

材 料 和 方 法

1 動物

雄性SD大鼠，體重180～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證號為SCXK(京)2012-0001。動物飼養(yǎng)于清潔級動物房，光照明暗各12 h(明7：00～19：00，暗19：00～7：00),恒溫、恒濕[室溫(21±1)℃，相對濕度40%～60%]，自由攝食，飲水。

2 試劑與儀器

2.1主要試劑 Leptin和LEPR ELISA試劑盒購自Phoenix Pharmaceuticals；RIPA裂解液購自Pierce Biotechnology；兔抗AgRP抗體購自Santa Cruz Biotechnology；兔抗 LEPR抗體購自Invitrogen；兔抗POMC抗體購自Signalway Antibody；兔抗NPY和兔抗CART抗體購自Cell Signaling Technology; 辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物公司；TRIzol購自Invitrogen；M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega；SYBR Green I熒光定量PCR試劑盒購自Fementas。

2.2主要儀器 T10型手持電動勻漿器購自IKA； SpectraMax? Plus 384讀板機(酶標(biāo)儀)購自MD； ND2000型微量分光光度計購自Thermo； ABI 7300 型熒光定量PCR System購自ABI； DYY-Ⅲ型電泳儀、DYY-Ⅲ40B型轉(zhuǎn)膜槽和DYCZ-24D型垂直電泳槽購自北京六一生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)購自UVP；3K15低溫離心機購自Sigma。

3 方法

3.1動物分組及模型制備 90只實驗大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周，隨機分為空白對照(blank control，BC)組、7 d應(yīng)激(7-d stress，7-S)組和21 d應(yīng)激(21-d stress，21-S)組，每組30只。應(yīng)激方法同參考文獻[1]，將大鼠束縛于特制的T型束縛架上，每日3 h，束縛時點隨機。7-S組和21-S組分別持續(xù)束縛應(yīng)激7 d和21 d;BC組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)21 d，不予束縛應(yīng)激干預(yù)。

3.2攝食量和體重檢測 稱量大鼠應(yīng)激前1 d(day 0)的體重和攝食量及應(yīng)激后連續(xù)21 d(day 1～day 21)的體重和攝食量。攝食量計算以前 1 d給食量減去當(dāng)天剩余食量。

3.3檢測標(biāo)本制備 7-S組于實驗第8天、BC組和21-S組于實驗第22天，以2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉，斷頭取血2 mL分離血清備用；冰盤上快速取腦，液氮速凍，摳取ARC組織，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.4ELISA法測定大鼠血清leptin及下丘腦ARC LEPR的含量 根據(jù)ELISA試劑盒操作說明，于酶標(biāo)儀上檢測血清leptin含量。另取腦組織ARC置1 mL NaCl溶液中煮沸3 min，加0.5 mL 1 mol/L冰醋酸，手持電動勻漿器勻漿，以0.5 mL 1 mol/L NaOH中和混勻，離心，取上清，根據(jù)試劑盒說明檢測ARC組織中LEPR蛋白含量。

3.5Western blot法測定下丘腦ARC中LEPR、NPY、AgRP、POMC和CART 的蛋白表達 ARC組織置EP管，加RIPA緩沖液 1 mL進行勻漿，冰浴反應(yīng)，充分裂解，離心，取上清，提取總蛋白，采用分光光度計測定蛋白含量。每個蛋白樣本取30 μg進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)至PVDF膜。用蒸餾水振蕩洗膜3次，每次5 min,然后以5%脫脂奶粉，脫色搖床搖動封閉1 h；TBST振蕩洗膜3次，每次5 min，加兔源性 I 抗(β-actin、LEPR、NPY、POMC和CART抗體的稀釋度均為1∶300，AgRP抗體的稀釋度為1∶200)，4 ℃孵育過夜；TBST振蕩洗膜3次，每次5 min，加入1∶3 000的 II 抗(山羊抗兔IgG-HRP)，4 ℃孵育1 h；TBST室溫洗膜3次，每次10 min，然后用TBS 洗膜5 min，化學(xué)發(fā)光法獲得目標(biāo)條帶。Image-Pro Plus 6.0軟件分析條帶積分吸光度(IA)，β-actin為內(nèi)參照，分別計算LEPR、NPY、AgRP、POMC和CART蛋白表達相對含量。

3.6RT-qPCR法測定下丘腦ARC中LEPR、NPY、AgRP、POMC、CART 的mRNA表達 每樣本50 μg，TRIzol法提取ARC組織總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計測定A260與A280，結(jié)果28S和18S條帶清晰可見，5S條帶較弱彌散，表明所提取總RNA降解較少，完整性良好；A260/A280比值在1.8～2.0之間，純度較高，可用于后續(xù)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

根據(jù)M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作，20 μL反應(yīng)體系(總RNA 1 μg)于PCR儀上42 ℃ 50 min，95 ℃ 5 min，滅活反轉(zhuǎn)錄酶，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，根據(jù)試劑盒說明操作，進行熒光定量PCR擴增：95 ℃ 5 min; DNA變性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，引物延伸72 ℃ 30 s，40個循環(huán)，于每個循環(huán)引物延伸時收集熒光信號。以β-actin 作為內(nèi)參照，空白對照組第1號樣品設(shè)定為標(biāo)準(zhǔn)1，SDSV1.3軟件分析獲得各樣本目的基因Ct值，ΔΔCt=(Ct實驗組-Ctβ-actin)-(Ct對照組-Ctβ-actin)，根據(jù)公式RQ=2-ΔΔCt計算各樣本LEPR、AgRP、NPY、POMC和CART mRNA表達量，用于統(tǒng)計分析。

LEPR的上游引物序列為5’-GCCAAAGTCAACTACGCTCTT-3’， 下游引物序列為5’-CTTCCATACGCAAACCCA-3’；NPY的上游引物序列為5’-CGTGTGTTTGGGCATTCT-3’， 下游引物序列為5’-CAGTGTCTCAGGGCTGGAT-3’；AgRP的上游引物序列為5’-CTGCCGCTTCTTCAATACC-3’， 下游引物序列為5’-CTTTGCCCAACATCCGTT-3’；POMC的上游引物序列為5’-TGCTTCAGACCTCCATAGACG-3’， 下游引物序列為5’-AGGGCTGTTCATCTCCGTT-3’；CART的上游引物序列為5’-GACATCTACTCTGCCGTGGA-3’， 下游引物序列為5’-CGGAAT GCGTTTACTCTTGA-3’；β-actin的上游引物序列為5’-GGTCATCACCATTGGCAA-3’， 下游引物序列為5’-GAGTTGAAGGTAGTTTCGTGGA-3’。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用一般線性模型的重復(fù)測量過程對體重和攝食量數(shù)據(jù)進行單變量方差分析，并用多因素方差分析LSD法進行相同時點上的兩組間比較；其它數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，多組間比較采用SNK-q法。21-S組大鼠體重/攝食量和下丘腦弓狀核食欲因子表達的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 慢性束縛應(yīng)激對大鼠體重和攝食量的影響

從表1可以看出，束縛應(yīng)激前，BC組和21-S組大鼠體重和攝食量的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。從束縛應(yīng)激第2天開始，在相同時點內(nèi)21-S組大鼠的體重明顯低于BC組(P<0.05或P<0.01)；從束縛第1天開始，在相同時點內(nèi)21-S組大鼠攝食量始終低于BC組，尤其在應(yīng)激第1、7、8、10、11及13～21天，2組間的差異最為明顯(P<0.05或P<0.01)，見表1。

2 慢性束縛應(yīng)激對大鼠血清leptin及下丘腦ARC中LEPR含量的影響

大鼠血清中l(wèi)eptin含量7-S組和21-S組較BC組均明顯增加(P<0.05)；7-S組和21-S組相比差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見表2。

大鼠下丘腦ARC中LEPR含量7-S組和21-S組較BC組均有所增加，尤其21-S組增加更為明顯(P<0.05)，見表2。

3 慢性束縛應(yīng)激對大鼠下丘腦ARC中 LEPR、NPY、AgRP、POMC和CART蛋白表達的影響

與BC組比較，7-S組和21-S組大鼠下丘腦的ARC中NPY和AgRP蛋白表達水平均顯著下降(P<0.05)，LEPR、POMC和CART的蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；21-S組較7-S組ARC中NPY和AgRP的蛋白表達水平明顯減少(P<0.05)，而LEPR和POMC表達則有所增高(P<0.05)，7-S組和21-S組大鼠下丘腦ARC中CART蛋白表達雖然也有所變化，但組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖1、表3。

表1 慢性束縛應(yīng)激對大鼠體重和攝食量的影響

*P<0.05,**P<0.01vsBC group at the same time point.

表2慢性束縛應(yīng)激對大鼠血清leptin和ARC中LEPR含量的影響

Table 2.The effects of chronic immobilization stress on serum leptin and LEPR in ARC of rats (Mean±SD.n=10)

GroupLeptin (μg/L)LEPR (μg/L)BC3.58±1.317.53±2.957-S 6.40±1.81?9.10±1.46?21-S6.71±1.42?11.69±2.14?#

*P<0.05vsBC group；#P<0.05vs7-S group.

4 慢性束縛應(yīng)激對大鼠下丘腦ARC 中LEPR、NPY、AgRP、POMC和CART mRNA表達的影響

7-S組和21-S組大鼠下丘腦ARC中NPY和AgRP的mRNA表達較BC組均顯著減少(P<0.05)，而LEPR和POMC的mRNA表達則不同程度增加(P<0.05)；21-S組與7-S組比較，大鼠下丘腦ARC中NPY和AgRP的mRNA表達下降(P<0.05)，而LEPR和POMC 的mRNA表達明顯增加(P<0.05)。3組比較，大鼠下丘腦ARC中CART的mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見表4。

Figure 1.The images of Western blot showed the effects of chronic immobilization stress on the protein expression of LEPR, NPY, AgRP, POMC and CART in ARC of the rats.

圖1Westernblot檢測慢性束縛應(yīng)激對大鼠下丘腦ARC中LEPR、NPY、AgRP、POMC和CART蛋白表達的影響

表3慢性束縛應(yīng)激對大鼠下丘腦ARC中LEPR、NPY、AgRP、POMC和CART蛋白表達的影響

Table 3.The effects of chronic immobilization stress on the protein expression of LEPR, NPY, AgRP, POMC and CART in ARC of rats (Mean±SD.n=3)

IndexBC7-S21-SLEPR0.22±0.010.45±0.05?0.60±0.07?#NPY0.97±0.020.76±0.03?0.27±0.01?#AgRP1.81±0.031.09±0.03?0.58±0.03?#POMC1.40±0.071.62±0.04?1.78±0.11?#CART1.63±0.081.98±0.02?2.05±0.08?

*P<0.05vsBC group；#P<0.05vs7-S group.

5 21-S組大鼠體重/攝食量與下丘腦ARC 中食欲因子表達的相關(guān)性

21-S組大鼠體重與其ARC中LEPR和CART的mRNA表達呈顯著負相關(guān)(P<0.05或P<0.01)，與

表4慢性束縛應(yīng)激對大鼠下丘腦ARC中LEPR、NPY、AgRP、POMC和CARTmRNA表達的影響

Table 4.The effects of chronic immobilization stress on the mRNA expression of LEPR, NPY, AgRP, POMC and CART in ARC of rats (Mean±SD.n=6)

IndexBC7-S21-SLEPR1.01±0.212.57±0.57?3.82±0.73?#NPY0.90±0.070.41±0.05?0.31±0.03?#AgRP0.97±0.090.80±0.08?0.42±0.09?#POMC0.43±0.070.54±0.08?0.86±0.08?#CART0.34±0.060.38±0.070.42±0.07

*P<0.05vsBC group;#P<0.05vs7-S group.

NPY的mRNA表達呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；攝食量與POMC的mRNA表達呈顯著負相關(guān)(P<0.05)。體重與攝食量無顯著相關(guān)性(P>0.05)，見表5。

表5 21-S組大鼠體重、攝食量及下丘腦弓狀核食欲因子mRNA表達的相關(guān)性

*P<0.05,**P<0.01.

討 論

應(yīng)激是機體整個適應(yīng)、保護機制的一個重要組成部分。適度應(yīng)激有利于機體在內(nèi)外環(huán)境中保持自身穩(wěn)態(tài)，而過強或持久、頻繁的應(yīng)激則可能誘發(fā)多種慢性疾病[2-4]。目前，束縛應(yīng)激是研究動物心理應(yīng)激反應(yīng)最常用的模型之一[5]。束縛制動使動物軀體活動受限，并由此產(chǎn)生掙扎、憤怒、焦慮、無助和抑郁等一系列情緒變化及皮毛無光，耳廓淡白，食欲下降和體重減輕等軀體癥狀，這既很好地模擬了機體在應(yīng)激狀態(tài)下心理和生理的變化，又避免了造模本身對軀體的直接病理損傷[6-7]。本研究結(jié)果證實，束縛應(yīng)激大鼠攝食量和體重較同期空白對照組大鼠明顯下降，且應(yīng)激時間越長，對體重增長影響越大，與前期研究結(jié)果一致[8]，說明慢性束縛應(yīng)激是影響機體能量儲備的不利因素之一。

目前普遍認為，下丘腦是機體中樞維持能量平衡的核心，包含多個與食欲調(diào)控有關(guān)的神經(jīng)核團，其中緊鄰第三腦室的ARC作為一個食欲調(diào)節(jié)和能量平衡的綜合體已成為廣大研究人員關(guān)注的焦點[9-10]。ARC包含2組與攝食相關(guān)但作用相反的一級神經(jīng)元NPY/AgRP和POMC/CART[11]，這些神經(jīng)元接收外周傳入的營養(yǎng)信息后，協(xié)同調(diào)控NPY、AgRP、POMC和CART等食欲因子的合成和分泌，并通過神經(jīng)纖維投射實現(xiàn)不同神經(jīng)核團之間的信號傳遞，最終維持下丘腦“食欲調(diào)節(jié)網(wǎng)”的平衡。

瘦素是一種能感知自身能量狀態(tài)的蛋白質(zhì)類激素。作為食欲調(diào)節(jié)鏈上關(guān)鍵的一環(huán)，瘦素由白色脂肪細胞分泌后，通過外周和中樞(主導(dǎo)作用)2條途徑參與機體能量代謝的調(diào)控。下丘腦ARC是瘦素中樞作用的關(guān)鍵部位。作為主要參與介導(dǎo)瘦素調(diào)節(jié)體重作用的功能性受體LEPR，在弓狀核促食欲NPY/AgRP神經(jīng)元及抑食欲POMC/CART神經(jīng)元均顯著表達[12-13]。經(jīng)血液循環(huán)進入下丘腦的瘦素，通過與LEPR特異性結(jié)合，將飽食信號傳遞給該處的瘦素反應(yīng)性食欲調(diào)控神經(jīng)元，激活食欲調(diào)節(jié)網(wǎng)，從而全面啟動攝食及能量平衡的瘦素調(diào)控通路。

下丘腦ARC的各種食欲因子是瘦素循環(huán)作用的直接靶點[14]。以往研究表明，NPY通過與ARC內(nèi)廣泛分布的NPY受體特異性結(jié)合，激發(fā)機體的攝食效應(yīng)[15-16]。AgRP是一種較NPY更為強效和長效的食欲刺激素。表達于ARC的POMC在前轉(zhuǎn)變素酶1的作用下釋放其剪切產(chǎn)物α-促黑素細胞激素(α-melanocyte-stimulating hormone，α-MSH)和促腎上腺皮質(zhì)激素，前者通過激活與機體新陳代謝密切相關(guān)的黑皮質(zhì)素受體3/4(MC3-R/MC4-R)，使機體產(chǎn)生飽腹感，并向其它腦區(qū)傳達飽食的信號，以減少攝食行為[17]。同時對MC3-R和MC4-R高度敏感的AgRP可通過與之競爭性結(jié)合，從而抑制黑皮素受體信號，拮抗α-MSH 的抑制攝食作用[18]。CART廣泛存在于與攝食及體重密切相關(guān)的腦區(qū)，與瘦素具有相互調(diào)節(jié)作用[19-20]，其強大的抑食功能已在嚙齒類動物和部分水生動物研究中被初步驗證[21-23]。

本研究結(jié)果表明，應(yīng)激因素對大鼠攝食行為及體重增長具有消極影響，并能顯著提高其血清瘦素水平，下調(diào)ARC中促食欲因子NPY和AgRP表達，上調(diào)抑食欲因子POMC和CART表達。進一步的Pearson相關(guān)分析結(jié)果提示以NPY/AgRP和POMC/CART為代表的2類食欲因子表達失衡可能是慢性束縛應(yīng)激大鼠出現(xiàn)攝食減少、體重增長緩慢的關(guān)鍵中樞神經(jīng)內(nèi)分泌基礎(chǔ)之一，但具體作用機制及通路的研究有待進一步開展。本研究同時發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激大鼠體重與攝食量之間并無顯著相關(guān)性，提示攝食量減少并非其體重增長延緩的唯一原因，很可能還與機體代謝水平有關(guān)，這已在本課題組基于代謝組學(xué)的相關(guān)研究中得到初步證實[24]，并將成為我們下一步深入研究的關(guān)注點之一。