石 彪，孫建利，許再超，李艷兵，杜金龍，孫曉光，黨翠玲

(承德市中心醫(yī)院 1急診外科， 2生殖醫(yī)學(xué)科， 河北 承德 067000)

急性胰腺炎是一種嚴(yán)重危害人類生命健康的疾病，其發(fā)生機制與胰腺腺泡細(xì)胞過度凋亡有關(guān)。雨蛙肽(caerulein)是常用的構(gòu)建急性胰腺炎模型誘導(dǎo)因子，具有很強的刺激膽囊收縮和分泌胰酶的作用，雨蛙肽可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)胰酶的活化，促進凋亡有關(guān)蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞凋亡[1-2]。β-連環(huán)蛋白(β-catenin)主要存在于細(xì)胞膜上，參與細(xì)胞之間的黏附及基因的表達(dá)轉(zhuǎn)錄過程，在內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞等各種類型的細(xì)胞中廣泛表達(dá)，β-catenin具有調(diào)控細(xì)胞的生長和凋亡等作用，在人類的多種疾病中異常表達(dá)[3-5]。最近的研究表明，β-catenin可能具有促進人胰腺腺泡細(xì)胞損傷后修復(fù)作用[6]。本次實驗研究用雨蛙肽處理胰腺腺泡細(xì)胞，明確β-catenin在胰腺炎腺泡細(xì)胞凋亡中的作用，為明確胰腺炎腺泡細(xì)胞損傷機制奠定基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 材料

大鼠胰腺腺泡AR42J細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。pcDNA3.1-β-catenin由吉滿生物科技(上海)有限公司構(gòu)建；雨蛙肽購自Sigma；抗β-catenin抗體購自Santa Cruz Biotechnology；Lipofectamine 2000購自Thermo Fisher Scientific；cDNA合成試劑盒和real-time PCR試劑盒購自TaKaRa；抗CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP)抗體和抗cleaved caspase-12抗體購自 Cell Signaling Technology；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)含量檢測試劑盒和淀粉酶(amylase，AMY)含量檢測試劑盒購自南京建成生物研究所。

2 方法

2.1細(xì)胞分組 AR42J細(xì)胞分成對照(control)組、caerulein組、pcDNA3.1+caerulein組和pcDNA3.1-β-catenin+caerulein組，共4組。處理方法如下：cae-rulein組：用不做轉(zhuǎn)染處理的AR42J細(xì)胞經(jīng)含有1×10-8mol/L雨蛙肽細(xì)胞培養(yǎng)液處理培養(yǎng)24 h；pcDNA3.1+caerulein組：收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染陰性對照pcDNA3.1的AR42J細(xì)胞，用含有1×10-8mol/L雨蛙肽細(xì)胞培養(yǎng)液處理培養(yǎng)24 h；pcDNA3.1-β-catenin+caerulein組：收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染β-catenin過表達(dá)載體pcDNA3.1-β-catenin的AR42J細(xì)胞，用含有1×10-8mol/L雨蛙肽細(xì)胞培養(yǎng)液處理培養(yǎng)24 h；control組：用不做轉(zhuǎn)染處理的AR42J細(xì)胞經(jīng)0 mol/L雨蛙肽細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染步驟同脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000，用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。采用real-time PCR和Western blot法分別檢測各組細(xì)胞中β-catenin表達(dá)的變化，明確雨蛙肽對AR42J細(xì)胞中β-catenin表達(dá)的影響及轉(zhuǎn)染后的過表達(dá)效果。

2.2Real-time PCR檢測β-catenin表達(dá)水平 取AR42J細(xì)胞，用TRIzol試劑提取各組胰腺腺泡細(xì)胞中的總RNA，RNA用DEPC去離子水懸浮溶解以后，分光光度計檢測濃度，其A260/A280的比值應(yīng)介于1.8～2.0之間，RNA在-80 ℃冰箱中保存。吸取0.5 μg的RNA進行cDNA反轉(zhuǎn)錄，程序為：50 ℃反應(yīng)20 min、99 ℃反應(yīng)5 min、5 ℃反應(yīng)5 min。用Primer 5設(shè)計β-catenin引物，引物交由上海生工合成。β-Catenin的上游引物序列為5′-GCTACTTGTTCTGAGTGAAG-3′，下游引物序列為5′-ATGGAACCAGACAGAAAAGC-3′;內(nèi)參照GAPDH的上游引物序列為5′-GGATTTGGTCGTATTGGG-3′，下游引物序列為5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′。PCR程序為：95 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃反應(yīng)1 min，共35個循環(huán)。結(jié)果采用2-ΔΔCt值表示。

2.3Western blot檢測β-catenin的蛋白表達(dá)水平 取AR42J細(xì)胞，在細(xì)胞中分別添加蛋白裂解液，按照BCA法對蛋白定量，把蛋白同5×loading buffer按照4∶1體積比混合后煮沸5 min。在每個上樣孔內(nèi)添加40 μg蛋白，SDS-PAGE凝膠用5% 濃縮膠，10%分離膠，在蛋白還沒有到達(dá)分離膠之前用80 V電壓電泳，到達(dá)分離膠之后把電壓調(diào)整到100 V。電泳結(jié)束后，在4 ℃、250 mA條件下把凝膠上的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜進行90 min。PVDF膜用5%牛血清白蛋白在37 ℃封閉1 h以后，置于 I 抗中4 ℃過夜， I 抗按照1∶200稀釋，再置于 II 抗37 ℃孵育1 h， II 抗按照1∶2 000稀釋，用ECL顯色試劑盒顯色以后，GAPDH為內(nèi)參照，用Quantity One分析各組目的條帶水平。各組細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)應(yīng)激蛋白CHOP和cleaved caspase-12水平的檢測方法同上。

2.4MTT法檢測細(xì)胞活力 取AR42J細(xì)胞，按照2×107/L接種到96孔板內(nèi)，按照方法2.1分組處理，培養(yǎng)24 h后，在每孔中加入20 μL的MTT，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，將孔內(nèi)的上清溶液吸棄，每個孔內(nèi)加入150 μL DMSO，10 min后，酶標(biāo)儀測定570 nm的吸光度(A)值，用不含細(xì)胞孔調(diào)零，把control組細(xì)胞活力作為100%，用caerulein、pcDNA3.1+caerulein和pcDNA3.1-β-catenin+cae-rulein各組吸光度值與control吸光度值比值變化作為各組細(xì)胞相對活力。

2.5二硝基苯肼法檢測LDH漏出率 離心后收集各組細(xì)胞沉淀，用生理鹽水洗滌以后，反復(fù)凍融5次以后，收集上清溶液，添加輔酶和基質(zhì)緩沖液，放在37 ℃水浴中孵育15 min后，加入2,4-二硝基苯肼工作液，在37 ℃孵育15 min后，添加0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液，混合后，在室溫中靜置3 min，檢測440 nm波長的吸光度值，用蒸餾水調(diào)零。同樣方法檢測培養(yǎng)液上清中LDH的水平。LDH漏出率(%)=上清中LDH吸光度值÷細(xì)胞總LDH吸光度值×100%。

2.6碘-淀粉比色法檢測AMY漏出率 離心后收集各組細(xì)胞沉淀，用生理鹽水洗滌以后，反復(fù)凍融5次以后，收集上清溶液，添加底物緩沖液，置于37 ℃中孵育8 min后，加入碘工作液，檢測660 nm波長的吸光度值，用蒸餾水調(diào)零。同樣方法檢測培養(yǎng)液上清中AMY的水平。AMY漏出率(%)=上清中AMY吸光度值÷細(xì)胞總AMY吸光度值×100%。

2.7流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡 取各組細(xì)胞，添加冰預(yù)冷的PBS懸浮以后，吸取1 mL各組細(xì)胞懸浮液，以1 000×g離心10 min后，添加500 μL結(jié)合緩沖液混合，繼續(xù)加入5 μL的PI和10 μL的Annexin V-FITC，室溫避光反應(yīng)10 min以后，立即用流式細(xì)胞儀測定各組細(xì)胞凋亡變化。

3 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組間比較用獨立樣本t檢驗，多組間比較用方差分析并用SNK-q進行各組均數(shù)間的兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 雨蛙肽處理后胰腺腺泡細(xì)胞中β-catenin表達(dá)水平降低

胰腺腺泡細(xì)胞經(jīng)過雨蛙肽處理以后，細(xì)胞中的β-catenin的mRNA和蛋白水平均明顯降低(P<0.05)，見圖1。這表明雨蛙肽誘導(dǎo)的胰腺腺泡細(xì)胞中β-catenin呈低表達(dá)。

Figure 1.The expression of β-catenin in the pancreatic acinar cells after treatment with caerulein. A: the results of Western blot for determining the protein level of β-catenin in the AR42J cells after treated with caerulein; B: the quantitative analysis of the β-catenin mRNA level. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1雨蛙肽處理后胰腺腺泡細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)水平降低

2 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-β-catenin促進雨蛙肽條件下胰腺腺泡細(xì)胞中β-catenin表達(dá)

胰腺腺泡細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-β-catenin后，經(jīng)過雨蛙肽處理，細(xì)胞中的β-catenin的mRNA和蛋白水平均明顯升高(P<0.05)，見圖2。

3 β-Catenin減少雨蛙肽刺激下胰腺腺泡細(xì)胞分泌LDH和AMY

雨蛙肽處理后的胰腺腺泡細(xì)胞的LDH和AMY漏出率明顯升高，而過表達(dá)β-catenin后的胰腺腺泡細(xì)胞經(jīng)過雨蛙肽處理后，細(xì)胞LDH和AMY漏出率明顯降低(P<0.05)，見表1。這表明β-catenin可拮抗雨蛙肽對胰腺腺泡細(xì)胞分泌LDH和AMY的促進作用。

4 β-Catenin提高雨蛙肽作用下胰腺腺泡細(xì)胞的活力

雨蛙肽處理后的胰腺腺泡細(xì)胞活力明顯降低，而過表達(dá)β-catenin后的胰腺腺泡細(xì)胞經(jīng)過雨蛙肽處理后，細(xì)胞活力升高(P<0.05)，見表1。這表明β-catenin可拮抗雨蛙肽對胰腺腺泡細(xì)胞活力的抑制作用。

5 β-Catenin減少雨蛙肽作用下胰腺腺泡細(xì)胞凋亡

雨蛙肽處理后的胰腺腺泡細(xì)胞凋亡率明顯升高，而過表達(dá)β-catenin后的胰腺腺泡細(xì)胞經(jīng)過雨蛙肽處理后，細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，見圖3。這表明β-catenin具有拮抗雨蛙肽對胰腺腺泡細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用。

6 β-Catenin降低雨蛙肽作用下胰腺腺泡細(xì)胞中CHOP和cleaved caspase-12蛋白水平

雨蛙肽處理后的胰腺腺泡細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白CHOP和cleaved caspase-12水平明顯升高，而過表達(dá)β-catenin后的胰腺腺泡細(xì)胞經(jīng)過雨蛙肽處理后，細(xì)胞中CHOP和cleaved caspase-12水平明顯降低(P<0.05)，見圖4。這表明β-catenin減少雨蛙肽誘導(dǎo)的胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

Figure 2.The expression of β-catenin in pancreatic acinar cells treated with caerulein after transfection. A: the results of Western blot for determining the protein level of β-catenin in the AR42J cells after transfection; B: the quantitative analysis of the β-catenin mRNA level. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscaerulein group and pcDNA3.1+caerulein group.

圖2轉(zhuǎn)染后經(jīng)雨蛙肽處理的胰腺腺泡細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)水平

表1各組胰腺腺泡細(xì)胞LDH和AMY漏出率及細(xì)胞活力的變化

Table 1.The changes of LDH and AMY leakage rates and viability of pancreatic acinar AR42J cells in each group (Mean±SD.n=3)

GroupLDH leakage rate (%)AMY leakage rate (%)Cell viability (%)Control18.65±1.4520.56±2.59100.00 Caerulein28.46±2.17&35.29±3.48&73.46±6.23&pcDNA3.1+caerulein29.14±1.56&34.71±3.20&72.92±7.16&pcDNA3.1-β-catenin+caerulein22.84±2.34&?28.55±2.76&?88.25±8.11&?

&P<0.05vscontrol group;*P<0.05vscaerulein group and pcDNA3.1+caerulein group.

Figure 3.β-Catenin reduced the apoptosis of pancreatic acinar AR42J cells induced by caerulein. Mean±SD.n=3.&P<0.05vscontrol group;*P<0.05vscaerulein group and pcDNA3.1+caerulein group.

圖3β-Catenin減少雨蛙肽誘導(dǎo)的胰腺腺泡細(xì)胞凋亡

討 論

急性胰腺炎可以分為輕、中、重癥，重癥胰腺炎進展迅速，能夠引起人體多器官功能障礙，急性胰腺炎的發(fā)生與胰酶激活后胰腺組織自身的消化有關(guān)，腺泡細(xì)胞損傷是胰腺炎發(fā)生的重要原因之一[7-9]。胰腺腺泡細(xì)胞是胰腺外分泌腺的主要組成部分，其可以分泌多種消化酶和電解質(zhì)等物質(zhì)，胰腺炎時，腺泡細(xì)胞中的胰酶異?；罨?，導(dǎo)致腺泡細(xì)胞發(fā)生自身消化，引起腺泡細(xì)胞凋亡，造成胰腺功能損傷[10-12]。

Figure 4.The effects of β-catenin on the expression of endoplasmic reticulum stress proteins in the pancreatic acinar AR42J cells induced by caerulein. Mean±SD.n=3.&P<0.05vscontrol group;*P<0.05vscaerulein group and pcDNA3.1+caerulein group.

圖4β-Catenin對雨蛙肽誘導(dǎo)的胰腺腺泡細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白表達(dá)的影響

本實驗的結(jié)果顯示，雨蛙肽處理后的胰腺腺泡細(xì)胞活力降低，細(xì)胞LDH及AMY的漏出率均明顯升高，細(xì)胞凋亡率升高，說明成功構(gòu)建了胰腺炎腺泡細(xì)胞損傷模型。

β-Catenin最初作為一種黏附分子被發(fā)現(xiàn)，β-catenin蛋白含有C末端、N末端及12個重復(fù)的Arm結(jié)構(gòu)，Arm結(jié)構(gòu)組成一個超螺旋結(jié)構(gòu)，參與細(xì)胞黏附，其N末端具有維持β-catenin穩(wěn)定性的作用，C末端參與調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[13-14]。β-Catenin在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中表達(dá)，在靜息狀態(tài)下，β-catenin多聚集在細(xì)胞膜上，只有少量的β-catenin游離于細(xì)胞漿內(nèi)[15]。已經(jīng)證實，β-catenin具有降低腫瘤細(xì)胞、心肌細(xì)胞等細(xì)胞凋亡水平的作用，在細(xì)胞生長中發(fā)揮促進作用，參與動脈粥樣硬化、缺血損傷和腫瘤等疾病發(fā)生過程[16-18]。最近的研究顯示，β-catenin對于胰島功能障礙無明顯作用，但能夠促進胰腺腺泡細(xì)胞損傷修復(fù)[6]。本實驗的結(jié)果表明，過表達(dá)β-catenin后胰腺腺泡細(xì)胞在經(jīng)過雨蛙肽處理后，細(xì)胞的活力升高，細(xì)胞凋亡減少，說明β-catenin具有保護胰腺炎腺泡細(xì)胞損傷的作用。

細(xì)胞凋亡的發(fā)生是一個生理過程，與細(xì)胞內(nèi)的多個信號傳導(dǎo)及蛋白調(diào)控有關(guān)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是近年來發(fā)現(xiàn)的除了死亡受體途徑和線粒體途徑之外的新凋亡途徑，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在細(xì)胞內(nèi)的分布極為廣泛，與脂質(zhì)、膽固醇等的合成密切相關(guān)，其可以通過caspase-12和CHOP等誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[19-22]。很多研究顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與急性胰腺炎的發(fā)病過程，是急性胰腺炎腺泡細(xì)胞凋亡發(fā)生主要途徑之一[23-24]。β-catenin具有抗凋亡作用，其參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡發(fā)生，而對于其具體的靶向調(diào)控機制尚不明確[25]。本實驗的結(jié)果顯示，雨蛙肽處理后的胰腺腺泡細(xì)胞中CHOP蛋白水平及caspase-12活化水平均明顯升高，并且β-catenin過表達(dá)可以減少CHOP表達(dá)及caspase-12活化水平，β-catenin能夠減少雨蛙肽誘導(dǎo)的胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

總而言之，β-catenin在急性胰腺炎腺泡細(xì)胞凋亡中發(fā)揮抑制作用，β-catenin具有減輕腺泡細(xì)胞損傷作用，其作用機制與降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平有關(guān)，β-catenin具體的如何靶向調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機制尚未研究，本研究也只在一種胰腺腺泡細(xì)胞中進行了體外實驗，后續(xù)會在原代腺泡細(xì)胞及體內(nèi)進行驗證。本實驗結(jié)果明確了β-catenin在雨蛙肽誘導(dǎo)的胰腺腺泡細(xì)胞凋亡中的作用，為研究胰腺炎腺泡細(xì)胞損傷提供了實驗依據(jù)。