五味子中山葡萄HPLC指紋圖譜的建立及其偽品鑒別

干建偉， 胡 敏， 錢廣生， 韋 婷

（1.四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川成都 610041；2.華潤三九 （雅安）藥業(yè)有限公司，四川雅安 625000）

五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實(shí)，習(xí)稱北五味子。秋季果實(shí)成熟時(shí)采摘，曬干或蒸后曬干，除去果梗和雜質(zhì)。作為一種傳統(tǒng)中藥，它具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心。臨床用于久嗽虛喘、夢遺滑精、遺尿尿頻、久瀉不止等癥[1］。在對五味子藥材的質(zhì)量檢查中發(fā)現(xiàn)有部分樣品存在偽品，常見的為南五味子。文獻(xiàn)主要對北五味子和南五味子物質(zhì)成分對比，建立高效液相色譜進(jìn)行鑒別[2-8］，主要是南五味子和北五味子中木脂素成分存在較明顯的差異，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在南五味子和北五味子中有其他類別偽品[9-12］。在檢驗(yàn)中首次發(fā)現(xiàn)另一類偽品，研究表明該偽品與文獻(xiàn)所描述的山葡萄類似[13］。 《中國藥典》中對五味子原料雜質(zhì)比例可接受范圍為1%，經(jīng)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該類偽品的比例在2%～4%，且難以發(fā)現(xiàn)及挑選，為了保證用藥安全，對該偽品五味子進(jìn)行高效液相色譜鑒別。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀 （美國Agilent公司）；島津UV-2600紫外-可見分光光度儀 （日本島津公司）；奧林巴斯BX43／DP26顯微鏡 （日本奧林巴斯公司）；BS244S電子天平 （德國賽多利斯公司）；XFB-200高速中藥粉碎機(jī) （吉首市中誠制藥機(jī)械廠）。

1.2 試劑 乙腈 （色譜純，德國Merk公司）；無水乙醇、水合氯醛 （分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）；超純水。

1.3 材料 五味子對照藥材購自中國食品藥品檢定研究院 （批號120922-201610）；五味子購于同仁堂 （批號20150901、20150902、20150903）， 經(jīng)華潤三九 （雅安）藥業(yè)有限公司唐莉副總工程師鑒定為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實(shí)；五味子 （批號161001、 161002、 161003、 161004、 161005、161007、 161008、 161009、 161010）， 購買于吉林市場，從其中挑選出五味子偽品。山葡萄采自東北野外，經(jīng)副總工程師唐莉鑒定為葡萄科葡萄屬植物山葡萄Vitis amurensis Rupr.的干燥成熟果實(shí)。

KM小鼠 [清潔級，來源于四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院（四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所），動(dòng)物合格證編號 SCXK [111]2013-15］。

2 方法與結(jié)果

2.1 鑒別

2.1.1 性狀

2.1.1 .1 五味子 本品呈不規(guī)則的球形或扁球形。表面暗紅色，皺縮，略顯干癟；有的表面出現(xiàn)“白霜”。果肉較少，種子1～2粒，腎形，表面棕黃色、有光澤，種皮薄而脆。

2.1.1 .2 山葡萄 本品呈不規(guī)則橢圓形。表面棕紅色、皺縮、略有光澤。果肉薄而軟，內(nèi)含種子4～5粒，相互抱合成近球形，種子之間被果肉隔開；種子黃棕色，種仁白色呈油性，倒卵圓形，基部有短喙，種臍在種子背面中部呈橢圓形，腹面中棱脊微突起，兩側(cè)洼穴狹窄呈條形，向上達(dá)種子中部或近頂端。

2.1.1 .3 偽品 與山葡萄性狀一致。摻偽北五味子藥材性狀圖，見圖1，油潤五味子、干癟五味子、偽品、山葡萄果實(shí)及種子性狀比較圖，見圖2。

圖1 摻偽北五味子藥材性狀Fig.1 Adulteration of S．chinensis

圖2 真?zhèn)纹肺逦蹲铀幉募捌浞N子性狀鑒別Fig.2 Identification of S．chinensis and its seed characters

2.1.2 顯微鑒別

2.1.2.1 供試品粗粉制備 取五味子偽品，在60℃以下烘烤約2 h，取出放入干燥器內(nèi)，約1 h（放至室溫）后取出，立即粉碎成粉，過4號篩，混合均勻。

2.1.2.2 對照藥材粗粉制備 取五味子對照藥材，按 “2.1.2.1”項(xiàng)下方法制備。同法制備山葡萄粗粉。

2.1.2.3 鑒別 取對照藥材和供試品粉末，按照顯微鑒別2015年版 《中國藥典》四部2001要求制片、檢查。

五味子種皮表皮石細(xì)胞表面觀呈多角形或長多角形，壁厚，孔溝極細(xì)密。種皮內(nèi)層石細(xì)胞呈多角形、類圓形或不規(guī)則形。果皮表皮細(xì)胞表面觀類多角形，垂周壁略呈連珠狀增厚，表面有角質(zhì)線紋，見圖3。

圖3 五味子粉末Fig.3 Powder of fruit from S．chinensis

山葡萄果皮表皮細(xì)胞表面呈類多角形、類方形，種皮表皮細(xì)胞數(shù)列類圓形，種皮表皮下石細(xì)胞表面呈類長方形、類方形，壁薄，具極細(xì)密的孔溝及紋孔，見圖4。

圖4 山葡萄粉末Fig.4 Powder of fruit from V．a(chǎn)murensis

偽品顯微鑒別結(jié)果與山葡萄一致，見圖5。

圖5 偽品粉末Fig.5 Powder of fruit from counterfeit

2.1.3 紫外鑒別

2.1.3.1 供試品溶液制備 取五味子偽品粉末（過4號篩）2.0 g，置于錐形瓶中，加100 mL純化水煎煮120 min，過濾，取濾液5 mL，稀釋8倍，攪勻即得。

2.1.3.2 對照溶液制備 取五味子對照藥材粉末（過4號篩）2.0 g，按 “2.1.3.1”項(xiàng)下方法制備，即得。同法制備山葡萄對照溶液。

2.1.3.3 紫外檢測 取供試品和對照溶液，按照紫外分光光度法2015年版 《中國藥典》四部0401檢查185～500 nm處紫外吸收，五味子于210 nm處有1個(gè)較高吸收峰值；偽品于200、320 nm處有較高吸收峰值；山葡萄于208、320 nm處有較高吸收峰值，五味子與山葡萄、偽品存在較大的紫外吸收差異，偽品與山葡萄紫外吸收基本一致，見圖6。

圖6 各樣品紫外光譜圖Fig.6 UV spectrogram of various samples

2.2 高效液相色譜鑒別

2.2.1 色譜條件 Waters symmetry shieldTMRP18色譜柱 （4.6 mm×250 mm， 5.0 μm）； 流動(dòng)相乙腈（A） -水（B）， 梯度洗脫 （0～10 min， 10%A； 10～20 min， 10% ～15%A； 20～65 min， 15% ～60%A；65～80 min， 60%A； 80～90 min， 60% ～80%A；90～100 min，80%～100%A）；柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL； 體積流量1.0 mL／min； 檢測波長210 nm。

2.2.2 對照溶液制備 精密稱定五味子粉末 （過4號篩）2.0 g，置于錐形瓶中，加入100 mL純化水煎煮120 min，過濾，濾液濃縮至10 mL，加入40 mL無水乙醇，攪勻后過濾，揮去部分乙醇轉(zhuǎn)移至量瓶中，定容至 10 mL。搖勻后，取溶液過0.45 μm微孔濾膜，收集濾液即得。

2.2.3 供試品溶液制備 精密稱定五味子偽品粉末 （過4號篩）2.0 g，按 “2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 精密度試驗(yàn) 取偽品樣品 （批號161001）粉末按 “2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.2.1”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測得各共有峰相對保留時(shí)間RSD 0.14%～1.36%，相似度均大于0.999，表明儀器精密度良好。

2.2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取偽品樣品 （批號161 0 01）粉末，混勻，精密稱取粉末 1.6、2.0、2.4 g各3份，按 “2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣檢測，測得各共有峰相對保留時(shí)間的RSD 0.78%～1.05%，相似度均大于0.989，表明該方法重復(fù)性好。

2.2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取偽品樣品 （批號161001）粉末，混勻，精密稱取粉末 2.0 g，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.2.1”項(xiàng)條件下，分別于 0、1、3、6、12、24 h進(jìn)樣，測得各共有峰相對保留時(shí)間的RSD 0.64%～1.36%，相似度均大于0.999，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 指紋圖譜建立及評價(jià) 取偽品樣品及五味子各10批，按 “2.2.2”及 “2.2.3”項(xiàng)下方法制備對照溶液及供試品溶液，在 “2.2.1”項(xiàng)條件下，進(jìn)樣分析，見圖7～8。偽品在80 min內(nèi)有10個(gè)峰為共有峰，其面積占所有色譜峰面積的92.0%以上。經(jīng)中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)[14］分析，相似度均在 0.90以上。五味子在80 min內(nèi)有11個(gè)峰為共有峰，與偽品的指紋圖譜完全不同。

圖7 10批偽品HPLC指紋圖譜Fig.7 HPLC fingerprint of ten batches of counterfeit

圖8 10批五味子HPLC指紋圖譜Fig.8 HPLC fingerprint of ten batches of S．chinensis

2.2.6 偽品鑒別 取偽品樣品，按照1%、2%、3%比例加入五味子中，按 “2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.2.1”項(xiàng)條件下，進(jìn)樣分析，指紋圖譜中2號特征峰為偽品中特有的成分，能夠通過2號特征峰顯著區(qū)別五味子中是否存在偽品，而且隨著偽品比例增加峰面積增加，見圖9～11。

圖9 1%偽品五味子HPLC色譜圖Fig.9 HPLC chromatogram of S．chinensis of 1%counterfeit

圖10 2%偽品五味子HPLC色譜圖Fig.10 HPLC chromatogram of S．chinensis of 2%counterfeit

圖11 3%偽品五味子HPLC色譜圖Fig.11 HPLC chromatogram of S．chinensis of 3%counterfeit

2.3 異常毒性分析

2.3.1 異常毒性檢測方法 取清潔級KM小鼠5只，3只雄性2只雌性，體質(zhì)量18～22 g。每只小鼠分別給予靜脈注射供試品溶液0.5 mL，在4～5 s內(nèi)勻速注射完畢。全部小鼠在給藥后48 h內(nèi)不得有死亡；如有死亡，應(yīng)另取體質(zhì)量19～21 g的小鼠10只復(fù)試，全部小鼠在48 h內(nèi)不得有死亡。

2.3.2 五味子中偽品占比較高時(shí)異常毒性

2.3.2.1 對照溶液制備 取五味子780 g按照生脈注射液提取工藝制備[15］，煎煮3次，每次加入3 L純化水，煎煮40 min。將煎煮液濃縮至比重1.19～1.20，用乙醇醇沉2次，第1次使醇度達(dá)到80%，第2次使醇度達(dá)到85%，過濾，調(diào)pH近中性，回收乙醇，加入3%活性炭煮沸30 min后脫炭。將五味子液分別按照五味子質(zhì)量濃度0.156、0.234、 0.312、 0.390 g／mL 配制成對照溶液，100℃，35 min滅菌。

2.3.2.2 供試品溶液制備 取五味子437 g和五味子偽品343 g，按 “2.3.2.1”項(xiàng)下方法制成供試品溶液。

2.3.2.3 異常毒性檢測 取對照溶液及供試品溶液，按 “2.3.1”項(xiàng)下方法檢測異常毒性，未見小鼠死亡，但五味子偽品異常毒性高于五味子。見表1。

表1 含偽品與五味子異常毒性結(jié)果Tab.1 Results of abnormal toxicity for S．chinensis and counterfeit

2.3.3 1%、2%、3%五味子偽品異常毒性比較 取五味子780 g，按照 “2.3.2.1”項(xiàng)下方法制備成 0.156 g／mL對照溶液。分別取五味子772.2 g、五味子偽品7.8 g，五味子764.4 g、五味子偽品15.6 g，五味子756.6 g、五味子偽品23.4 g，按照 “2.3.2.1”項(xiàng)下方法制備成0.156 g／mL供試品溶液。

取對照溶液及供試品溶液檢測異常毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)偽品比例較低時(shí)異常毒性與五味子無顯著差異。見表2。

表2 含五味子偽品1%、2%、3%樣品異常毒性結(jié)果Tab.2 Results of abnormal toxicity for 1%，2%and 3%counterfeit samples

3 討論

3.1 偽品分析 通過粉末顯微比較研究，發(fā)現(xiàn)偽品與五味子藥材之間差異明顯，外觀性狀方面與干癟型五味子較相似，與油潤性五味子差異較大。偽品的性狀、顯微鑒別與山葡萄一致，由此可確證五味子的此種偽品為葡萄科葡萄屬植物山葡萄的干燥成熟果實(shí)。經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該山葡萄在青果時(shí)采摘晾干，被混入野生干癟型五味子中，由于家種五味子采摘后性狀為油潤型，性狀差異與野生五味子有較明顯差異，暫未發(fā)現(xiàn)有山葡萄混入。

3.2 小結(jié) 本研究對偽品山葡萄的異常毒性進(jìn)行了評價(jià)，在山葡萄比例加入到接近50%時(shí)略有毒性反應(yīng)加強(qiáng)的現(xiàn)象，而在3%以內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)異常毒性加強(qiáng)，表明現(xiàn)有摻入比例對產(chǎn)品的異常毒性暫未出現(xiàn)顯著影響，臨床使用暫不能評價(jià)，應(yīng)注意隨著五味子價(jià)格上漲引起偽品摻入比例增加。

現(xiàn)階段在干癟類五味子中發(fā)現(xiàn)摻雜偽品，而油潤型的五味子中暫未發(fā)現(xiàn)該類偽品，建立的高效液相色譜指紋圖譜分析方法可通過特征峰確定是否有山葡萄加入，方法靈敏有效，可有效控制偽品的加入，用于五味子的質(zhì)量控制。