李喚宇，高原，牟光慶，妥彥峰

（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連116034）

有氧呼吸提供了人類(lèi)生命所需的能量，是人類(lèi)不可缺少的生理過(guò)程。在此過(guò)程中，部分氧氣會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）與自由基。正常情況下機(jī)體維持氧化—還原平衡，但是當(dāng)ROS與自由基累積過(guò)多，或者機(jī)體處于病變狀態(tài)時(shí)，這種平衡就會(huì)被打破。多余的活性氧與自由基會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等生物大分子進(jìn)行攻擊，從而引發(fā)各類(lèi)疾病如炎癥、癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化、阿茨海默癥等[1-2]。

乳酸菌在自然界中分布廣泛，大醬、饅頭、酸奶等食品的發(fā)酵過(guò)程均有乳酸菌的參與，人類(lèi)食用乳酸菌的歷悠久；人類(lèi)和動(dòng)物腸道中乳桿菌屬、雙歧桿菌屬均是腸道中正常菌群。乳桿菌屬、雙歧桿菌屬的某些菌株被證實(shí)具有提高免疫力、降血壓、抗氧化、改善腸道菌群等生理功能[3-4]。

體外試驗(yàn)、體內(nèi)試驗(yàn)均指出某些乳桿菌屬、雙歧桿菌屬的乳酸菌具有抗氧化功能[5]。因此，具有抗氧化功能的乳酸菌作為一種有效的天然抗氧化劑，其抗氧化活性日漸成為研究熱點(diǎn)。有多種研究乳酸菌抗氧化活性的評(píng)價(jià)，乳酸菌發(fā)揮抗氧化活性的機(jī)理也被不斷提示。本文擬對(duì)研究乳酸菌抗氧化活性的不同方法及乳酸菌發(fā)揮抗氧化活性的機(jī)理進(jìn)行分析。

1 乳酸菌抗氧化活性評(píng)價(jià)體系

乳酸菌抗氧化活性的測(cè)定主要通過(guò)對(duì)其完整菌體細(xì)胞，無(wú)細(xì)胞提取物、發(fā)酵上清液以及胞外多糖等通過(guò)不同的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。這些方法包括體外化學(xué)評(píng)價(jià)方法、細(xì)胞模型評(píng)價(jià)方法以及體內(nèi)評(píng)價(jià)方法等。

1.1 抗氧化活性體外化學(xué)評(píng)價(jià)方法

乳酸菌體外化學(xué)抗氧化活性實(shí)驗(yàn)方法，即通過(guò)體外化學(xué)方法模擬氧化還原反應(yīng)進(jìn)行研究，一般包括清除自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、螯合金屬離子等方法[5]。Lin等[6]測(cè)定出嗜酸乳桿菌ATCC 4356以及長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC 15708對(duì)DPPH自由基清除率為21%～52%，對(duì)小鼠血漿脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率為11%～29%。劉洋等[7]對(duì)發(fā)酵乳桿菌、乳酸乳球菌、嗜酸乳桿菌和瑞士乳桿菌抗氧化能力進(jìn)行比較，其中瑞士乳桿菌的羥自由基清除能力、DPPH自由基清除能力相對(duì)較高，乳酸乳球菌和嗜酸乳桿菌清除超氧陰離子能力相對(duì)較強(qiáng)，發(fā)酵乳桿菌抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力為最強(qiáng)。王剛等[8]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌CCFM8661和干酪乳桿菌CCFM1566還原力分別達(dá)到（226.47±4.68）、（212.35±6.45）μmol/L 半胱氨酸當(dāng)量，對(duì)DPPH自由基和羥基自由基清除率均在60%以上，并具有較高的亞鐵離子及銅離子螯合能力。上述研究均未反映這些菌株在攝入機(jī)體后的抗氧化活性。

盡管抗氧化體外化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法具有直接快速、易于比較的特點(diǎn)，對(duì)乳酸菌抗氧化性能的評(píng)價(jià)中起到了重要的作用，但這些化學(xué)方法易受外界環(huán)境因素的影響，例如DPPH法易受光照、氧濃度、溶劑類(lèi)型和反應(yīng)溫度等條件的影響[9]；氧化自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）法的熒光指示劑對(duì)pH值敏感，測(cè)試溫度對(duì)測(cè)試結(jié)果也有很大影響。每種抗氧化活性測(cè)定都有一個(gè)特定的目標(biāo)，這導(dǎo)致其測(cè)定目標(biāo)局限在自身的優(yōu)點(diǎn)上。例如Mu等[10]的研究發(fā)現(xiàn)DPPH自由基清除法與ORAC測(cè)試的結(jié)果并沒(méi)有很大的關(guān)聯(lián)性。

而且采用化學(xué)方法測(cè)定的某物質(zhì)的抗氧化活性是否反映它在體內(nèi)抗氧化活性受到質(zhì)疑。因而化學(xué)抗氧化活性測(cè)定法不能全面地反應(yīng)乳酸菌等菌株的抗氧化活性，更不能反映菌株在機(jī)體內(nèi)的抗氧化作用。因此，有必要進(jìn)一步驗(yàn)證乳酸菌在攝入機(jī)體后的抗氧化活性。

1.2 抗氧化活性細(xì)胞模型評(píng)價(jià)方法

由于動(dòng)物試驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)、成本高的特點(diǎn)，采用人源或動(dòng)物源細(xì)胞系建立抗氧化細(xì)胞模型，用來(lái)評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化功能，得到研究者的廣泛認(rèn)可和采用。

Wolfe等[11]報(bào)道了一種利用人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞的細(xì)胞抗氧化活性（cellular antioxidant activity，CAA）試驗(yàn)方法，該方法具有較好的生物相關(guān)性，因?yàn)榭紤]到了抗氧化物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的吸收、代謝和分布。自CAA方法于2007年成立以來(lái)，它已被廣泛應(yīng)用和開(kāi)發(fā)，許多抗氧化劑已經(jīng)使用CAA測(cè)定法進(jìn)行了評(píng)估。CAA的原理如圖1所示。

圖1 CAA原理示意圖[11]Fig.1 Schematic diagram of CAA

概括為ABAP會(huì)在細(xì)胞外以及細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生氧自由基，細(xì)胞用熒光指示劑處理后，DCFH-DA探針在進(jìn)入細(xì)胞后會(huì)分解成DCFH，在細(xì)胞內(nèi)會(huì)受到氧自由基的影響從而生成具有熒光性的物質(zhì)DCF，可以通過(guò)測(cè)量細(xì)胞的熒光強(qiáng)度判斷細(xì)胞的氧化水平；具有抗氧化性質(zhì)的物質(zhì)將會(huì)在細(xì)胞外及細(xì)胞內(nèi)清除氧自由基，阻止氧自由基與DCFH反應(yīng)，因而減少DCF的產(chǎn)生，降低細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，并且抗氧化劑的抗氧化效果越強(qiáng)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度就越低，因此可以通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度判斷抗氧化劑的抗氧化能力。

Xing等[12]對(duì)13種乳桿菌菌株的無(wú)細(xì)胞懸浮液和菌株懸浮液的抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明RAW264.7，Caco-2和EA.hy926細(xì)胞系可用作細(xì)胞模型來(lái)測(cè)定乳酸桿菌的細(xì)胞抗氧化活性，通過(guò)對(duì)10株乳酸菌進(jìn)行DPPH自由基清除測(cè)定與細(xì)胞模型評(píng)價(jià)方法對(duì)比，發(fā)現(xiàn)CAA可能是檢測(cè)乳桿菌菌株抗氧化活性的更好選擇[13]。CAA測(cè)定是評(píng)估抗氧化活性的良好方法，CAA測(cè)定比傳統(tǒng)化學(xué)方法更具生物學(xué)相關(guān)性并且也與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)有所不同，因?yàn)樗葎?dòng)物和臨床模型更經(jīng)濟(jì)和有效。Mu等[10]用一系列方法評(píng)價(jià)篩選菌株的抗氧化活性，研究結(jié)果表明植物乳桿菌Y44與其他菌株相比具有明顯優(yōu)異的抗氧化活性，通過(guò)CAA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌菌株Y3、Y44和鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus GG，LGG） 的 CAA 值分別為 11.10、15.76、8.61 μmol/L槲皮素當(dāng)量，其中植物乳桿菌Y44表現(xiàn)出顯著高于鼠李糖乳桿菌LGG的CAA值（p＜0.05），說(shuō)明植物乳桿菌Y44具有高的體外抗氧化能力。

通過(guò)使用氧化劑如H2O2或ABAP作用細(xì)胞建立細(xì)胞氧化損傷模型，使用乳酸菌作用氧化損傷細(xì)胞，通過(guò)測(cè)量細(xì)胞的存活率以及細(xì)胞內(nèi)相關(guān)物質(zhì)如抗氧化酶等物質(zhì)的表達(dá)，對(duì)乳酸菌的抗氧化效果進(jìn)行評(píng)估。細(xì)胞抗氧化實(shí)驗(yàn)反映了抗氧化物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的吸收、代謝和分布等方面，比化學(xué)抗氧化方法更具有生物相關(guān)性，能更好地預(yù)測(cè)物質(zhì)在體內(nèi)的抗氧化活性。Seth A等[14]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鼠李糖乳桿菌LGG產(chǎn)生的可溶性蛋白能夠通過(guò)加強(qiáng)Caco-2單層細(xì)胞中緊密連接蛋白和屏障功能從而減輕過(guò)氧化氫對(duì)細(xì)胞的損傷，從而提高細(xì)胞的存活率。Mu等[10]的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在建立的與H2O2組相比，乳酸桿菌菌株Y44預(yù)處理過(guò)的HT-29細(xì)胞在暴露于H2O2的環(huán)境下存活率顯著提高，Bax/Bcl-2比率顯著降低（p＜0.05），Hsp70表達(dá)顯著降低，并顯著恢復(fù)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）活性，降低 HT-29細(xì)胞的丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平（p＜0.05）表明植物乳桿菌 Y44有效保護(hù)HT-29細(xì)胞免受氧化應(yīng)激，說(shuō)明乳桿菌菌株Y44可以有效緩解由H2O2誘導(dǎo)的HT-29細(xì)胞凋亡并通過(guò)上調(diào)抗氧化酶活性提高HT-29細(xì)胞的抗氧化力。

雖然細(xì)胞模型評(píng)價(jià)方法具有諸多優(yōu)點(diǎn)，但是此方法仍舊是一種體外模擬方法，不能確定對(duì)宿主整體的影響。細(xì)胞模型介質(zhì)中很多對(duì)脂溶性植物化學(xué)物質(zhì)不相溶，一般都需要用其他試劑過(guò)渡，因引入了不必要的干擾物質(zhì)，影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

體外細(xì)胞培養(yǎng)模式并不能完全代表抗氧化物質(zhì)在生物體內(nèi)的代謝和作用情況，因?yàn)椴皇侨魏位瘜W(xué)物質(zhì)經(jīng)消化后都能被吸收進(jìn)入人體肝臟細(xì)胞或到達(dá)上述的有關(guān)細(xì)胞，所以大部分細(xì)胞抗氧化實(shí)驗(yàn)直接用提取物做細(xì)胞模型可能與人體的攝入含植物化學(xué)物質(zhì)的食物后的實(shí)際情況有很大差別，一般先要經(jīng)人體各種消化酶和消化條件降解后，或腸胃細(xì)菌酵解后再做細(xì)胞模型測(cè)試結(jié)果相對(duì)可靠，因此細(xì)胞抗氧化實(shí)驗(yàn)面臨的最大挑戰(zhàn)就是將結(jié)果與體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相聯(lián)系，判斷其是否能預(yù)測(cè)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果[15]。

1.3 抗氧化活性體內(nèi)研究評(píng)價(jià)方法

體內(nèi)試驗(yàn)可以直接、清晰地評(píng)判乳酸菌抗氧化能力。這種方法與真實(shí)的氧化反應(yīng)擬合度更高，更加速了乳酸菌抗氧化的研究。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)主要是指通過(guò)建立動(dòng)物氧化模型，例如大鼠或小鼠高脂膳食氧化損傷模型等，通過(guò)測(cè)定待測(cè)物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液、器官或組織的生理生化指標(biāo)如抗氧化酶、MDA等的影響評(píng)價(jià)抗氧化活性。有研究表明乳酸菌可以通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)抗氧化基因的表達(dá)量，或通過(guò)上調(diào)Nrf2信號(hào)通路及其下游蛋白HO-1等的表達(dá)，從而提高宿主細(xì)胞抗氧化酶活性[16]。孟和畢力格等[17]研究結(jié)果表明嗜酸乳桿菌MG2-1能夠顯著提高大鼠肝臟組織中SOD活力和GSH-PX活力，顯著地降低大鼠血液和肝臟組織勻漿中MDA含量（p＜0.05），表明明嗜酸乳桿菌MG2-1具有優(yōu)良的體內(nèi)抗氧化能力。干酪乳桿菌Zhang可以顯著提高大鼠血漿和肝臟中SOD活力和GSH-Px活力，顯著降低MDA含量（p＜0.05），緩解內(nèi)毒素和D-半乳糖引起的大鼠的氧化應(yīng)激[18]。

雖然動(dòng)物模型和人體研究是更合適評(píng)判乳酸菌抗氧化能力的方法，但試驗(yàn)成本高，周期長(zhǎng)，以及潛在安全風(fēng)險(xiǎn)問(wèn)題，更適合驗(yàn)證單一菌株的抗氧化活性而不是篩選，不適合用于乳酸菌抗氧化能力評(píng)價(jià)的前期試驗(yàn)。因此，需要更多的研究來(lái)比較不同的方法和評(píng)估益生菌的抗氧化性能。而結(jié)合化學(xué)抗氧化方法和抗氧化細(xì)胞模型可以是篩選具有抗氧化活性的乳酸桿菌菌株的有效方法。

1.4 抗氧化活性分子生物學(xué)研究評(píng)價(jià)方法

國(guó)內(nèi)外對(duì)乳酸菌抗氧化的研究多數(shù)是通過(guò)如自由基清除能力，對(duì)細(xì)胞抗氧化酶系的影響，以及簡(jiǎn)單的動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)等測(cè)定，不能確定抗氧化作用的主要物質(zhì)。因此研究者們開(kāi)始利用分子生物學(xué)方法對(duì)不同物質(zhì)抗氧化作用進(jìn)行驗(yàn)證。

WhiB-like家族蛋白質(zhì)是雙歧桿菌普遍存在的蛋白，Averina O V等[19]通過(guò)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（fluorescence quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)QPCR）法發(fā)現(xiàn)WhiB-like家族蛋白質(zhì)在氧脅迫下大量表達(dá)，并且認(rèn)為其對(duì)雙歧桿菌響應(yīng)氧脅迫起重要作用，因而可以使雙歧桿菌耐受氧脅迫。植物乳桿菌WCFS1、德式乳桿菌保加利亞亞種以及乳酸乳球菌耐受氧脅迫時(shí)分解代謝控制蛋白的表達(dá)，可以提高其在氧脅迫下存活率[20-22]。

不僅蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)有助于乳酸菌對(duì)氧脅迫耐受，某些轉(zhuǎn)錄因子被發(fā)現(xiàn)參與了乳酸菌響應(yīng)氧脅迫過(guò)程。植物乳桿菌CAHU2的維持體內(nèi)銅離子平衡轉(zhuǎn)錄因子CopR缺失突變體對(duì)過(guò)氧化氫極為敏感，回補(bǔ)突變體顯著提高植物乳桿菌CAHU2在過(guò)氧化氫脅迫下的存活率，研究者認(rèn)為由于轉(zhuǎn)錄因子CopR調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)銅離子濃度，抑制了Feton反應(yīng)（芬頓反應(yīng)），提高了CAHU2對(duì)過(guò)氧化氫的耐受能力[23]。

研究發(fā)現(xiàn)不同乳酸菌表達(dá)有關(guān)清除活性氧的酶或者蛋白具有種間差異，由此導(dǎo)致不同乳酸菌表達(dá)的不同抗氧化物質(zhì)決定了乳酸菌抗氧化活性的差異[24]。近些年，研究者們利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)以及蛋白質(zhì)組學(xué)方法能對(duì)乳酸菌抗氧化的有關(guān)基因、蛋白質(zhì)等高通量篩選，具有快速以及全面等優(yōu)勢(shì)。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)綜合應(yīng)用可以充實(shí)現(xiàn)有的蛋白質(zhì)組和遺傳學(xué)知識(shí)，對(duì)乳酸菌抗氧化活性研究進(jìn)行更深層次的理解。Oberg T S等[25]比較了長(zhǎng)乳桿菌NCC2705在不同時(shí)間H2O2脅迫下的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)差異，在暴露于過(guò)氧化氫5 min后NCC2705有288個(gè)基因表達(dá)具有差異；而暴露于過(guò)氧化氫60 min后，NCC2705只有114個(gè)基因差異表達(dá)；其中編碼硫氧還蛋白、硫氧還蛋白還原酶、過(guò)氧化物酶、鐵氧化還原蛋白和谷氧還蛋白等抗氧化酶基因表達(dá)顯著上調(diào)。Xiao M等[26]研究長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN86氧脅迫下蛋白質(zhì)組學(xué)，經(jīng)過(guò)2-DE分離后有51個(gè)顯著變化的點(diǎn)；其中包括烷基過(guò)氧化物還原酶、吡啶核苷二硫化物還原酶、DNA結(jié)合鐵蛋白、核糖核酸還原酶以及焦磷酸水解酶。

2 乳酸菌抗氧化體系

乳酸菌多為厭氧或兼性厭氧類(lèi)的細(xì)菌。雖然乳酸菌抗氧化體系不全面，但是乳酸菌進(jìn)化出具有自己獨(dú)特的抗氧化體系抑制活性氧對(duì)自身的損傷，比如胞內(nèi)各類(lèi)抗氧化物質(zhì)、氧化還原調(diào)節(jié)系統(tǒng)以及氧化損傷修復(fù)系統(tǒng)[27]。三者相互作用，通過(guò)抑制各種ROS和自由基的生成，清除已形成的ROS和自由基等作用，以及保護(hù)生物大分子免受氧化損傷及對(duì)受損生物大分子的修復(fù)。例如硫氧還蛋白基因的表達(dá)可提高超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）等抗氧化酶的活性，在一定條件下，硫氧還蛋白還可促進(jìn)氧化型谷胱甘肽[Glutathione（Oxidized），GSSG]向還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）的轉(zhuǎn)變[28]。

2.1 抗氧化酶

乳酸菌細(xì)胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)多為抗氧化酶類(lèi)物質(zhì)。當(dāng)乳酸菌面臨氧脅迫時(shí)，其自身會(huì)產(chǎn)生一些物質(zhì)如抗氧化酶等將ROS及其代謝產(chǎn)物分解或還原，催化ROS使其生成毒性較低的物質(zhì)。同時(shí)ROS與自由基對(duì)抗氧化酶也有失活作用，造成酶活力降低。乳酸菌主要抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）等[29]。

2.1.1 超氧化物歧化酶（SOD）

超氧化物歧化酶是一類(lèi)催化超氧化物進(jìn)行歧化反應(yīng)生成H2O2與O2的酶類(lèi)。發(fā)酵乳桿菌E-3、E-18，短乳桿菌P68，植物乳桿菌L1001等具有良好抗氧化活性的乳酸菌都發(fā)現(xiàn)具有SOD活性[30-31]。通過(guò)對(duì)SOD異源表達(dá)，可以顯著提高長(zhǎng)雙歧桿菌NCC2705、干酪乳桿菌以及鼠李糖乳桿菌耐受活性氧能力[32-33]。

2.1.2 過(guò)氧化氫酶（CAT）

乳酸菌一直被認(rèn)為是一類(lèi)缺乏過(guò)氧化氫酶的微生物，直到近年來(lái)一些實(shí)驗(yàn)證明了某些小球菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬和明串珠菌屬菌株中存在編碼過(guò)氧化氫酶基因或表達(dá)過(guò)氧化氫酶活性。過(guò)氧化氧酶一般可以分為2類(lèi)，主要的區(qū)別在于催化氧化還原反應(yīng)所需要的輔助因子不同，輔助因子即血紅素鐵和非血紅素錳。由于這些乳酸菌由于缺乏亞鐵血紅素合成能力，所以只有在添加外源血紅素的情況下才具有過(guò)氧化氫酶的活性[34]。Yousten等[35]通過(guò)比對(duì)CAT活性不同的植物乳桿菌在有氧、厭氧條件下生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化氫酶可以減少氧氣對(duì)乳酸菌產(chǎn)生的潛在損傷。Hayashi等[36]發(fā)現(xiàn)星狀雙歧桿菌編碼一個(gè)氧誘導(dǎo)血紅素依賴(lài)型過(guò)氧化氫酶，可以提高其對(duì)氧脅迫的耐受。Kono等[37]在植物乳桿菌中發(fā)現(xiàn)并分離純化出了一種不依賴(lài)于亞鐵血紅素的假性過(guò)氧化氫酶，隨后克隆出了它的基因，這種酶被命名為MnKat，，它是種含錳離子過(guò)氧化氫酶[38]。通過(guò)對(duì)過(guò)氧化氫酶異源超量表達(dá)，不僅能提高乳酸菌耐受氧脅迫能力，并且有效提高該菌株緩解小鼠腸炎功能[39]。

當(dāng)乳酸菌只存在單一種類(lèi)的抗氧化酶時(shí)，表現(xiàn)出的抗氧化能力是有限的，抗氧化酶之間的保護(hù)作用是相互影響相互促進(jìn)的，進(jìn)而發(fā)揮高效的抗氧化作用。Zuo等[40]研究表明，長(zhǎng)雙歧桿菌氧耐受能力在CAT與SOD共同作用時(shí)明顯提高。

2.2 氧化還原調(diào)控系統(tǒng)

雖然乳酸菌表達(dá)抗氧化物質(zhì)具有種間差異，其中最主要的氧化還原調(diào)控系統(tǒng)包括谷胱甘肽（Glutathione）系統(tǒng)、硫氧還蛋白（Thioredoxin）系統(tǒng)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）氧化酶/NADH 過(guò)氧化酶系統(tǒng)[27]。氧化還原調(diào)控系統(tǒng)可以相互合作清除活性氧與自由基，同時(shí)使抗氧化酶恢復(fù)活性，持續(xù)保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷。

2.2.1 谷胱甘肽（glutathione）系統(tǒng)

谷胱甘肽系統(tǒng)由谷胱甘肽（glutathione，GSH）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）以及谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）組成。GSH-Px以還原型谷胱甘肽為底物催化過(guò)氧化物分解，同時(shí)生成沒(méi)有抗氧化活性的氧化型谷胱甘肽；氧化型谷胱甘肽被GR還原為還原型谷胱甘肽，繼續(xù)作為GSH-Px底物分解過(guò)氧化物。發(fā)酵乳桿菌ME-3被發(fā)現(xiàn)具有GSH、GSH-Px以及GR的完整谷胱甘肽系統(tǒng)，其有助于ME-3耐受氧脅迫以及活性氧脅迫[41]。Wang T等[42]構(gòu)建了嗜熱鏈球菌SDMCC18編碼GSH的gshF缺失突變體，發(fā)現(xiàn)突變體在氧脅迫以及過(guò)氧化氫脅迫下存活率顯著降低；當(dāng)外源添加GSH后，突變體在氧脅迫以及過(guò)氧化氫脅迫下存活率顯著提高。GSH是一種非蛋白硫醇化合物，存在于大多數(shù)的乳酸菌中。GSH的前體半胱氨酸、γ-谷氨酰半胱氨酸也具有抵抗氧脅迫的作用[43]。乳酸菌細(xì)胞中硫氧還蛋白基因的表達(dá)可提高超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶的活性[44]。

2.2.2 硫氧還蛋白（thioredoxin）系統(tǒng)

硫氧還蛋白系統(tǒng)由硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx），硫氧還蛋白還原酶（TrxR）和還原型輔酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）組成，是一類(lèi)抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵調(diào)控系統(tǒng)。Trx是一類(lèi)催化氧化還原的小分子多肽，具有高度保守的序列，其調(diào)節(jié)氧化還原反應(yīng)的位點(diǎn)是Cys-Gly-Pro-Cys[45]。硫氧還原蛋白系統(tǒng)主要有以下作用：直接傳遞電子給抗氧化酶，加快抗氧化酶清除自由基或活性氧的速率；還原被氧化損傷的蛋白質(zhì)類(lèi)以及核酸，還原二硫鍵，恢復(fù)抗氧化酶的活性；調(diào)節(jié)對(duì)氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子活性[46-47]。Serrano等[48]從植物乳桿菌WCFS1中鑒定出了編碼TrxR的基因trxB1，發(fā)現(xiàn)在植物乳桿菌中異源超量表達(dá)TrxR可很好地提高其耐受氧化應(yīng)激性的能力。

2.2.3 NADH氧化酶/NADH過(guò)氧化酶系統(tǒng)

NADH氧化酶可以通過(guò)NADH排除乳酸菌細(xì)胞內(nèi)的氧分子，產(chǎn)生H2O2或H2O。因此NADH氧化酶可以分為兩類(lèi)：NADH-H2O2氧化酶或是NADH-H2O氧化酶。NADH-H2O2氧化酶可直接將H2O2還原為水，但這種酶在氧化脅迫時(shí)降解過(guò)氧化氫的效率較低，只是作為一種協(xié)同的氧化防御機(jī)制[49]。J?nsc等[50]構(gòu)建了舊金山乳桿菌NADH氧化酶缺失突變體，該突變體對(duì)活性氧敏感，生長(zhǎng)受到顯著抑制。Kang T S等[51]研究發(fā)現(xiàn)NADH氧化酶/NADH過(guò)氧化酶系統(tǒng)可以使乳桿菌PM1在能量代謝直接使用氧分子，生成額外腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）為自身供能。發(fā)現(xiàn)兩歧雙歧桿菌中表達(dá)b型乳清酸脫氫酶可以起到NADH-H2O2氧化酶作用[52]。

2.3 氧化損傷修復(fù)系統(tǒng)

機(jī)體不能完全抵御活性氧與自由基攻擊時(shí)，會(huì)造成蛋白質(zhì)、核酸、生物膜和脂類(lèi)等破壞性的損壞，其中以蛋白質(zhì)氧化損傷和DNA氧化損傷為主。氧化損傷修復(fù)系統(tǒng)被認(rèn)為是抗氧化應(yīng)激的最終機(jī)制[53]。RecA蛋白是一種普遍存在于細(xì)菌中的蛋白質(zhì)，在氧化損傷修復(fù)系統(tǒng)中起到修復(fù)損傷DNA作用[54]。Duwat等[55]研究發(fā)現(xiàn)乳酸乳球菌中RecA蛋白參與了響應(yīng)氧化應(yīng)激與熱休克反應(yīng)，修復(fù)受損傷的DNA，以使其發(fā)揮正常的遺傳信息載體。瑞士乳桿菌CNBL1156在紫外線(xiàn)輻射和氧化應(yīng)激條件下能激活uvrA基因，修復(fù)受損蛋白質(zhì)或DNA，提高菌株耐受氧脅迫能力[56]。

表1 乳酸菌抗氧化功能研究進(jìn)展Table 1 Research progress on antioxidant function of lactic acid bacteria

3 研究進(jìn)展及存在問(wèn)題

大量文獻(xiàn)報(bào)道了乳桿菌菌株的抗氧化潛力，但由于使用不同的方法測(cè)試抗氧化活性，結(jié)果以各種單位表示，這使得不同乳酸菌菌株之間的抗氧化性能難以比較。乳桿菌菌株能夠以不同方式表現(xiàn)出抗氧化活性，同一株菌在不同抗氧化試驗(yàn)方法中體現(xiàn)出的異同點(diǎn)應(yīng)加以分析，明確菌株發(fā)揮作用的生物大分子，明確現(xiàn)象背后的機(jī)制。Xing等[13]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DPPH自由基清除率測(cè)定與CAA細(xì)胞模型評(píng)價(jià)方法對(duì)比，發(fā)現(xiàn)CAA實(shí)驗(yàn)更加適合檢測(cè)乳桿菌菌株抗氧化活性。Mu等[10]通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同的抗氧化測(cè)定方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互關(guān)聯(lián)性是不同的，通過(guò)對(duì)比抗氧化化學(xué)方法與抗氧化細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法之間的關(guān)聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)羥自由基清除實(shí)驗(yàn)和ORAC實(shí)驗(yàn)與細(xì)胞過(guò)氧化氫氧化損傷模型的關(guān)聯(lián)性強(qiáng)。

續(xù)表1 乳酸菌抗氧化功能研究進(jìn)展Continue table 1 Research progress on antioxidant function of lactic acid bacteria

隨著越來(lái)越多的抗氧化物質(zhì)在乳酸菌中被發(fā)現(xiàn)，這些抗氧化物質(zhì)作用機(jī)制分別是什么以及各種抗氧化物質(zhì)之間相關(guān)性等問(wèn)題有待進(jìn)一步解決，而且乳酸菌對(duì)宿主保護(hù)作用也是其抗氧化活性重要的一部分。生物體內(nèi)自由基的種類(lèi)、產(chǎn)生機(jī)理、產(chǎn)生部位及所作用的靶點(diǎn)不同，相對(duì)應(yīng)的抗氧化劑的抗氧化機(jī)理就不同。乳酸菌因其自身表達(dá)抗氧化物質(zhì)不同，抗氧化活性不盡相同。因此，對(duì)同一菌株應(yīng)系統(tǒng)地研究其抗氧化效果，并確定發(fā)揮作用的生物大分子，深入探討相應(yīng)抗氧化機(jī)制，全面體現(xiàn)生物學(xué)意義。人體與動(dòng)物的生理活動(dòng)以及新陳代謝不同，因此評(píng)價(jià)乳酸菌對(duì)人體的抗氧化活性需要臨床實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[75]。人體實(shí)驗(yàn)具有局限性和復(fù)雜性，并且研究具有一定的風(fēng)險(xiǎn)安全問(wèn)題，研究周期長(zhǎng)，因此目前關(guān)于乳酸菌抗氧化活性的臨床研究較少。乳酸菌定植在人體腸道，從而影響人體的消化、吸收、代謝等生理活動(dòng)。因此，評(píng)價(jià)乳酸菌抗氧化活性對(duì)人體的作用是一項(xiàng)復(fù)雜的工程，需要建立一套全面且標(biāo)準(zhǔn)的評(píng)價(jià)體系。

4 展望

乳酸菌是食品工業(yè)中重要微生物，在肉制品、乳制品、果蔬以及飲料市場(chǎng)上具有廣闊的應(yīng)用前景。氧化應(yīng)激與人們的生活息息相關(guān)，氧化可以導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，例如癌癥、炎癥和衰老等，因此抗氧化劑越來(lái)越受到人們的青睞，而具有良好抗氧化功能的乳酸菌是天然的抗氧化劑。篩選具有抗氧化活性的乳酸菌將作為發(fā)酵工業(yè)的發(fā)酵菌種，對(duì)提高食品品質(zhì)具有重要意義?？寡趸脑u(píng)價(jià)方法有許多，不同的抗氧化評(píng)價(jià)方法側(cè)重點(diǎn)和機(jī)理不同，適用于評(píng)價(jià)乳酸菌抗氧化性能的方法有很多限制，因此，建立一套全面且標(biāo)準(zhǔn)的評(píng)價(jià)乳酸菌抗氧化活性體系是目前急需解決的問(wèn)題?？焖贉?zhǔn)確的篩選具有抗氧化活性的乳酸菌，是有效研究抗氧化功能乳酸菌的基礎(chǔ)，對(duì)乳酸菌在抗氧化市場(chǎng)的應(yīng)用具有重要意義。