金槐ISSR-PCR反應體系的優(yōu)化研究

傅 鵬，陳恒宇，謝 鋒，笪舫芳，王孝勛，高 潔，曾錦燕

（廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530001）

槐花為豆科植物槐Sophora japonica L.的干燥花及花蕾，前者習稱“槐花”，后者習稱“槐米”。金槐Sophora japonica cv.Jinhuai是從槐樹中選育出的優(yōu)良栽培品種；因其槐米顏色金黃，故名為金槐［1］?；泵字懈缓J丁、槲皮素、桑色素等黃酮類物質［2］，其蘆丁的含量較高，在醫(yī)藥工業(yè)中常以槐米為原料提取蘆?。?］，蘆丁也是其有效成分和指標成分［4］?，F有研究表明，蘆丁和槲皮素具有廣泛的藥理活性［5］，尤其在心腦血管疾病治療中發(fā)揮著獨特的功效［6］。開展金槐的種質資源研究，了解金槐遺傳變異水平和基因組進化分類體系，探尋遺傳多樣性和金槐品種的相關性，挖掘金槐的優(yōu)良品種，并指導金槐的良種選育、品種鑒定，對于金槐產業(yè)經濟的發(fā)展具有重要意義。為此，需要建立一套有效、快速、穩(wěn)定的鑒定體系為金槐質量提供保障。

ISSR（inter simplesequencerepeat）分子標記是以植物中廣泛存在的微衛(wèi)星序列為基礎，開發(fā)出以簡單重復序列為單引物進行多位點PCR擴增的檢測技術。該標記的首要特點就是引物設計無需預知分析物種的基因組序列，能夠直接擴增2個序列相同但方向相反的反向重復序列之間的DNA片段。ISSR技術具有操作簡單，且同時綜合了其他分子標記多態(tài)性好、可重復性、低成本以及無需知道基因組序列等優(yōu)點［7］。由于植物基因組中微衛(wèi)星廣泛分布，且等位變異特別豐富，采用ISSR擴增條帶多態(tài)性較豐富，因此被認為是一種理想的遺傳標記。目前廣泛用于植物研究，可對植物進行基因定位［8］、指紋圖譜［9］、品種鑒定［10］及遺傳多樣性［11］等研究。

目前，唐健民等［12］對金槐的ISSR-PCR反應體系進行了相關的研究，并就Mg2+、dNTPs、引物、模板DNA、Taq酶的濃度建立了金槐ISSR-PCR反應體系。而且也有較多相關研究就上述五種因素建立了多種植物的ISSR-PCR反應體系［13-15］。但是隨著科學技術的發(fā)展，發(fā)現傳統(tǒng)的ISSR-PCR體系由于操作繁瑣等原因，產生的誤差較大，并不能達到很高的重復性和快速鑒定的效果。PCRMaster MIX是目前市面上很常見的一種常規(guī)PCR預混合液，含有Taq DNA Polymerase、dNTP混合物、MgCl2以及優(yōu)化的緩沖體系。反應時需要加入引物和模板即可進行擴增，能夠大大簡化實驗的操作步驟，減少實驗操作誤差，增強擴增效果，提高實驗的重復性。本實驗采用上海翊圣生物科技有限公司的2×HieffTMPCRMaster MIX對金槐的ISSR-PCR反應體系進行探索，以期為金槐品種建立一種分子標記技術快速鑒定的技術。現報道如下。

1 實驗材料

1.1 供試品 金槐ISSR分子材料取自廣西臨桂地區(qū)的金槐嫩葉，采摘后用硅膠干燥保存并帶回室內，于-20℃冰箱中保存。

1.2 主要儀器 PCR儀（BIO-RADT100 Thermal Cycler）；DDY-6C型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；BIO-RAD凝膠成像儀（BIO-RAD GelDoc XR+）；Merck Millipore Direct-Q 3，5，8純水／超純水一體機（德國默克集團）；H1650-W型離心機（湘儀）；MLS-3781L-PC型滅菌鍋（日本松下）；超微量分光光度計（北京天根）；TGemspectrophotometer Plus、移液槍等。

1.3 試劑 2×HieffTMPCR Master MIX（上海翊圣生物科技有限公司）；無菌無酶水［生工生物工程（上海）股份有限公司］；10×PCR buffer、Mg2+、dNTP、TaqDNA 聚合酶、模板 DNA、DNA Marker、ISSR-PCR 引物（華大基因）、EB液、瓊脂糖等。

2 方法

2.1 DNA提取與檢測 采用改進的CTAB方法［16］進行金槐DNA的提取，并于超微量分光光度計檢測DNA濃度，最后置于-20℃冰箱保存。

2.2 ISSR-PCR反應體系的對比 參考ISSR引物的設計，選用哥倫比亞大學（Universityof British Columbia，UBC）公布的序列。本文選用的兩套引物分別是UBC840［（GA）8YT］和 UBC843［（CT）8RA］。分別設計兩組：組別1采用傳統(tǒng)擴增體系和上述兩套引物對金槐DNA進行擴增，組別2將使用PCRMaster MIX（常規(guī)PCR預混合液）和上述兩套引物對金槐DNA進行擴增。組別1將參考同種植物金槐的PCR反應體系，在 25 μl反應體系中含有：10×PCRbuffer 2.5 μl，MgCl22.5 mmol/L，ISSR 引物 0.6 μmol/L，dNTPs 0.25 mmol/L，Taq酶 1.0 U，模板 DNA 約 50 ng；組別 2 參考 2×HieffTMPCRMaster MIX說明書的反應體系，在25μl的體系中含有：2×HieffTMPCR Master MIX 12.5 μl，ISSR 引物0.6μmol/L，模板DNA約50 ng。擴增程序參考唐健民等［12］和 2×HieffTMPCRMaster MIX 說明書：94℃預變性5 min，然后進行94℃變性30 s，退火45 s（退火溫度根據引物Tm值在PCR儀上進行40℃～60℃之間的梯度設置，PCR儀將形成8個溫度梯度，即：40℃、41.3℃、43.7℃、47.6 ℃、52.2 ℃、55.8 ℃、58.4 ℃、60.0 ℃），35 個循環(huán)，72℃延伸7 min，最后于4℃保存。取經上樣緩沖液染色后的擴增產物10μl，在2%瓊脂糖凝膠和0.5×緩沖電泳液中電泳，電泳條件設置為：恒壓155 V電泳30～40 min，即染色帶移動至約瓊脂糖凝膠的2/3位置處，然后將電泳后的瓊脂糖凝膠放置于EB液（0.5 μg/ml）中染色 10 min，最后放置于 BIO-RAD 凝膠成像系統(tǒng)中拍照。

3 結 果

3.1 金槐DNA樣品的質量檢測 用天根超微量分光光度計分析所提樣本DNA濃度和質量。核酸濃度在160～220 ng/μl之間，DNA 在 260 nm 和 280 nm 波長下的吸光度比值（OD260/OD280）在 1.70～1.90 之間，說明DNA純度較高，蛋白和RNA的污染都比較少。所以，樣本所提取的DNA質量和濃度符合要求，可以進行后續(xù)試驗。

3.2 ISSR-PCR反應體系的對比與直觀分析 在BIO-RAD凝膠成像儀下觀察不同引物分別在兩個ISSR-PCR體系中的擴增條帶，見圖1，圖2。對比圖1和圖2可以明顯看到，組別2的條帶清晰，條帶數明顯比組別1多。可以看出PCRMaster MIX的擴增效果明顯比傳統(tǒng)擴增體系好。

4 討論

PCR反應體系按照以往的研究方式一般都會對Mg2+、引物、dNTPs、DNA模板和Taq酶的濃度進行探索，得出最佳的ISSR-PCR反應體系，但根據實驗研究發(fā)現，按以往的方法摸索得到的ISSR-PCR反應體系操作較繁瑣，反復凍融也容易導致試劑失活，容易產生較大的實驗誤差，最終導致實驗的重復性下降，難以達到鑒別的效果。而采用PCRMaster MIX進行金槐DNA-PCR擴增，所得效果明顯，條帶清晰，條帶數目多，一是因為PCR Master MIX是即用型的常規(guī)PCR預混合溶液，減少了試劑的多次凍融導致失活；二是加入了穩(wěn)定劑，增加了試劑的穩(wěn)定性，提高了擴增的效果。本研究對比了引物UBC840和引物UBC843分別在不同體系的擴增效果，采用了梯度溫度進行擴增，結果對比性強，結果清晰，各個溫度都能明顯看到PCRMaster MIX的擴增效果更好。ISSR分子標記在鑒定領域中應用廣泛，而PCR擴增正是ISSR分子標記必不可少的步驟，快速穩(wěn)定的擴增效果將直接提高分子鑒定的穩(wěn)定性和可靠性。PCRMaster MIX的擴增效果穩(wěn)定、效率高，使分析結果更加科學可靠，更具說服力，可為今后的分子鑒定提供一個更好的選擇。

圖1 組別1采用傳統(tǒng)擴增體系擴增金槐DNA

圖2 組別2使用PCR Master MIX擴增金槐DNA