程筱雯

1948年，法國科學(xué)家Mandel首次描述了人類血液中存在游離的無細(xì)胞核酸片段（cell-free DNA，cfDNA）。1977年，Leon等［1］第一次報告了腫瘤患者血清中cfDNA水平增高，遠(yuǎn)高于健康人群。隨后不久研究者［2-4］就在腫瘤患者血液中發(fā)現(xiàn)了與結(jié)直腸癌、胰腺癌及肺癌相關(guān)的KRAS突變，而且在血漿中發(fā)現(xiàn)的KRAS突變與患者腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)的KRAS突變相同，證實了血漿中的突變DNA片段來源于腫瘤，突變的cfDNA是腫瘤高度特異性的生物學(xué)標(biāo)志物，研究者從而提出了“循環(huán)腫瘤DNA”（circulating tumor DNA，ctDNA）的概念，ctDNA是一些從腫瘤細(xì)胞釋放至血液中的DNA片段。

Vogelstein［5］在 1999 年利用數(shù)字 PCR（digital PCR，dPCR）技術(shù)實現(xiàn)了罕見突變片段的準(zhǔn)確識別和絕對量化，使在不同病情階段的結(jié)直腸癌患者血漿中突變的等位基因比例得以量化。2012年，F(xiàn)orshew等［6］使用標(biāo)記的擴增子片段對cfDNA中多個基因進(jìn)行了深度測序，證明了直接在癌癥患者血漿中鑒定突變的可能性，且能夠在單個測定中監(jiān)測多種腫瘤特異性突變。此后不久，血漿cfDNA的全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）被證明能夠識別腫瘤衍生的染色體畸變、聚焦擴增和基因重組［7-8］。2013年新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志指出，無創(chuàng)ctDNA檢測能夠真實反映實體瘤組織中基因突變頻率及圖譜，是療效評估及預(yù)后監(jiān)測的重要指標(biāo)［9］。

本文主要從ctDNA檢測方法、ctDNA在腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療中的應(yīng)用及ctDNA檢測分析面臨的挑戰(zhàn)等方面進(jìn)行綜述，以期進(jìn)一步探討ctDNA切實可行的臨床應(yīng)用方向。

1 ctDNA的檢測方法

1.1 dPCR

微流控平臺上的dPCR被廣泛用于量化ctDNA 水平［10］。dPCR 是分配擴增，終點檢測，先將樣品稀釋到單分子水平，再平均分配到20 000個單元中進(jìn)行反應(yīng)，每個單元包含一個或多個拷貝DNA模板，在每個反應(yīng)單元中分別對靶分子進(jìn)行PCR擴增，擴增結(jié)束后對每個反應(yīng)單元的熒光信號進(jìn)行收集，利用泊松分布的數(shù)學(xué)模型計算目標(biāo)片段拷貝數(shù)，可以實現(xiàn)單分子DNA絕對定量。dPCR可更好地檢測稀有突變，且常用于癌癥熱點突變分析，其缺點是僅檢測已知突變且通量低，如樣品需分成多個反應(yīng)，會增加采樣誤差，并損害極低拷貝數(shù)突變體DNA檢測的整體性能。

1.2 擴增受阻突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system，ARMS）

該法檢測已知突變，利用模板和引物堿基錯配有效抑制PCR反應(yīng)區(qū)分等位基因。根據(jù)已知點突變設(shè)計引物，其3′端堿基分別與突變和正常模板堿基互補，堿基與模板互補后，則引物不間斷延伸，PCR正常進(jìn)行得到特定長度擴增帶。反之，則不能延伸，從而區(qū)分有某種點突變的模板與正常模板。該法檢測靈敏度高，檢測限可達(dá)100 copies/mL，對腫瘤組織檢測限可達(dá)到0.1%的突變率［11］。ARMS結(jié)合實時PCR可實現(xiàn)閉管擴增，步驟簡便，產(chǎn)物無需后處理，從而最大程度地防止了擴增產(chǎn)物污染，現(xiàn)已成為國際上腫瘤個體化分子檢測最重要、最先進(jìn)的技術(shù)之一，臨床應(yīng)用認(rèn)可率高［12］。

1.3 磁珠乳液擴增方法（bead emulsion amplification magnetic，BEAMing）

該方法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)和dPCR，利用特異性引物擴增靶突變區(qū)，與磁珠混合進(jìn)行油包水單分子擴增反應(yīng)。磁珠上固定有特異PCR引物，每一類DNA分子專一與磁性珠相連。反乳化過程使得顏色各異的熒光探針結(jié)合磁珠上的PCR產(chǎn)物，發(fā)出綠色或紅色熒光，使用流式細(xì)胞儀分析磁珠顏色來確定突變情況。這種方法是基于小珠（bead）、乳濁液（emulsion）、擴增（amplification）、磁性（magnetic）這4個主要組分來構(gòu)建的，故被稱為BEAMing。該法用于檢測血液樣品中低拷貝數(shù)的已知基因突變效果較好。但此技術(shù)成本高、操作復(fù)雜，且成功率偏低，目前臨床應(yīng)用率低［13］。

1.4 測序技術(shù)

NGS技術(shù)的出現(xiàn)使得在保證敏感性的基礎(chǔ)上檢測出盡可能多的ctDNA中腫瘤特異性的基因突變或是拷貝數(shù)異常成為可能，包括未知突變的檢出。NGS的優(yōu)勢是能一次性對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定，通過增加測序深度可使靈敏度達(dá)到0.01%甚至更高的水平，是目前公認(rèn)最有效的分析方法［14-16］。

標(biāo)記擴增深度測序（tagged-amplicatiom deep sequencing，TAM-Seq）技術(shù)利用定制化突變位點庫作為篩選器，對樣本進(jìn)行靶向捕獲后再進(jìn)行深度測序，其對腫瘤靈敏度更高，特異性更強，與全外顯子測序相比經(jīng)濟可行。腫瘤個體化深度測序（cancer personalized protiling by deep sequence，CAPP-Seq）技術(shù)的基本原理是先利用特異性引物進(jìn)行15個循環(huán)目標(biāo)區(qū)域預(yù)擴增，再利用不同特性的接頭標(biāo)簽進(jìn)行二次擴增，通過雙向重復(fù)測序提高了測序精度，特異性和敏感性較高，成本較低，適于臨床應(yīng)用［17］。TAM-Seq和 CAPP-Seq主要針對已知突變檢測，而全基因組測序、全外顯子測序技術(shù)則可檢出未知突變。然而，上述測序在臨床實際應(yīng)用中尚存在諸多問題，由這些技術(shù)帶來的昂貴費用和龐大數(shù)據(jù)，及如何獲取高質(zhì)量DNA樣本是目前需要克服的問題［15，18］。

2 ctDNA在腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療中的應(yīng)用

2.1 ctDNA與腫瘤的分期和預(yù)后相關(guān)

一項包括有640例不同類型和分期的癌癥患者的研究發(fā)現(xiàn)，Ⅳ期癌癥患者的ctDNA濃度與Ⅰ期患者相比增加了100倍［19］，表明血漿中ctDNA的濃度可能與腫瘤發(fā)展階段相關(guān)。ctDNA濃度變異主要由癌癥轉(zhuǎn)移擴散程度或疾病負(fù)荷的差異造成。有實驗提示復(fù)發(fā)性高級漿液性卵巢癌患者ctDNA水平與腫瘤體積顯著相關(guān)，腫瘤體積每增加1立方厘米，每毫升血漿則增加6個突變體拷貝［20］。ctDNA濃度顯著變化可能與個體差異相關(guān)，如腫瘤血管形成可能阻礙ctDNA釋放入血液，或者可通過產(chǎn)生缺氧和細(xì)胞死亡來促進(jìn)ctDNA釋放。ctDNA水平與癌癥分期關(guān)系表明ctDNA可作為預(yù)后指標(biāo)［21-22］。具有可檢測ctDNA的結(jié)直腸癌患者的2年總體生存率為48%，而沒有ctDNA的患者則為100%［23］，相比常規(guī)蛋白質(zhì)類腫瘤標(biāo)志物，ctDNA是具有更好監(jiān)測效果的預(yù)后預(yù)測因子，ctDNA濃度越高，影像學(xué)檢查結(jié)果和臨床療效就越差。一項對轉(zhuǎn)移性乳腺癌的研究發(fā)現(xiàn)ctDNA濃度與總體存活率間存在顯著相反關(guān)系，ctDNA濃度高于2 000 copies/mL的患者預(yù)后均很差［24］。

2.2 ctDNA在腫瘤早期診斷中的應(yīng)用

癌癥的早期干預(yù)可明顯改善患者生存質(zhì)量，許多研究已證明了無創(chuàng)技術(shù)進(jìn)行疾病早期診斷的潛在價值［25-26］。有研究顯示82%Ⅳ期癌癥患者檢測到ctDNA，而Ⅰ期患者檢出率在47%［19］。50%Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌（non small-cell lung cancer，NSCLC）患者可檢測到ctDNA［27］。使用dPCR技術(shù)在早期乳腺癌患者血漿中顯示了93.3%的突變敏感性［28］。一種基于無創(chuàng)產(chǎn)前檢測（noninvasive prenatal testing，NIPT）技術(shù)改編的淺層全基因組測序（shallow whole-genome sequencing，sWGS）方法最近被應(yīng)用于臨床研究，檢測出了16例早期卵巢癌病例中的6例（37.5%）［29］。這些研究提示了早期癌癥中ctDNA檢測的可能性。

2.3 ctDNA在腫瘤組織定位中的應(yīng)用

cfDNA中的甲基化和核小體占有模式可以編碼組織特異性和細(xì)胞特異性信息，研究血漿中組織特異性甲基化信號，使每個組織對整個cfDNA池的相對貢獻(xiàn)量子化，這使得今后通過測定組織特異性ctDNA來確定癌癥轉(zhuǎn)移擴散部位或位點成為可能［30-31］，即提示了來自液體活檢的原始組織信息可能有助于腫瘤定位。

2.4 ctDNA在腫瘤病情實時監(jiān)測中的應(yīng)用

ctDNA半衰期短以及可重復(fù)采樣的特點，使液體活檢能夠?qū)崟r監(jiān)測腫瘤負(fù)荷對治療效果的反應(yīng)程度。在治療期間對患者進(jìn)行的研究顯示［6，32］，ctDNA 動力學(xué)與治療反應(yīng)相關(guān)，并且可以比臨床檢測更早地識別反應(yīng)。在復(fù)發(fā)性卵巢癌中，化療后ctDNA減少程度與進(jìn)展時間顯著相關(guān)，并且比CA125水平更有價值［20］。

最近的一項研究表明［33］，在黑素瘤患者免疫治療開始后的第一周，ctDNA水平的早期尖峰可能反映出細(xì)胞死亡數(shù)目的短暫增加，然而，這種細(xì)胞死亡峰值可能會根據(jù)所使用的藥物的藥理學(xué)特性和對它們的生物反應(yīng)而變化。在結(jié)直腸癌患者化療早期以及NSCLC患者接受表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGER）抑制劑治療后早期，未發(fā)現(xiàn)早期尖峰的出現(xiàn)，如果在治療開始后立即對血漿進(jìn)行分析可以可靠地檢測出敏感性癌細(xì)胞的破壞，這表明也許可以利用突變的早期動力學(xué)差異來快速鑒定抗性亞克隆的存在［34］。在免疫治療的背景下，液體活檢可以通過從不同的T細(xì)胞克隆釋放的cfDNA的分析來提供監(jiān)測ctDNA和免疫系統(tǒng)反應(yīng)的機會［35］。另外，在手術(shù)或治療后，沒有任何其他臨床證據(jù)時，ctDNA的存在可識別可能患有復(fù)發(fā)風(fēng)險的患者，即ctDNA的檢測有助于微小殘留?。╩inimal residual disease，MRD）的診斷［36］。

2.5 ctDNA在腫瘤異質(zhì)性分析中的應(yīng)用

在對腫瘤的深入研究中，人們逐漸認(rèn)識到腫瘤異質(zhì)性的潛在混雜效應(yīng)，但對患者行多次腫瘤活檢通常既不可行也不可取。單獨活檢的分析可能無法準(zhǔn)確反映患者基因組結(jié)構(gòu)，進(jìn)而會對個性化藥物的選擇和療效產(chǎn)生錯誤判斷。ctDNA從多個腫瘤區(qū)域釋放，從而可以反映腫瘤異質(zhì)性和空間分離的病灶，ctDNA分析可檢測到在相應(yīng)組織樣品中已經(jīng)漏掉的突變［37］，比傳統(tǒng)活檢更全面地分析腫瘤異質(zhì)性。有一項晚期胃癌ctDNA的研究分析了70例晚期胃癌患者ctDNA和配對腫瘤組織中人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor recepter，HER2）擴增的一致性，比較了其中30例晚期胃癌患者的ctDNA和原發(fā)腫瘤的突變譜，其中5例患者多次組織活檢以對腫瘤突變進(jìn)行綜合分析，結(jié)果顯示ctDNA中大多數(shù)突變也顯示在成對的腫瘤組織中，ctDNA與腫瘤組織的HER2擴增具有高度一致性（91.4%，Kappa指數(shù)=0.784，P＜0.001），這意味著基于ctDNA的評估可以部分克服腫瘤的異質(zhì)性，并可能成為胃癌HER2分析的潛在替代指標(biāo)［38］。

多區(qū)域腫瘤測序數(shù)據(jù)顯示［39-40］，腫瘤原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶組織中存在相同的固有突變，這種固有突變在血漿ctDNA中的檢出率高于區(qū)域腫瘤的個體突變檢出率，因此檢測這種固有突變對于跟蹤血漿腫瘤負(fù)荷（腫瘤負(fù)荷是指人體中腫瘤細(xì)胞的數(shù)量、腫瘤的大小或腫瘤病灶的總量）將是一種可靠的方法。

3 ctDNA檢測分析面臨的挑戰(zhàn)

盡管ctDNA與臨床表型的相關(guān)性已得到證實，但要提高其在臨床應(yīng)用的準(zhǔn)確性，仍需大規(guī)模人群隊列研究，而提高ctDNA分析質(zhì)量是成功應(yīng)用的關(guān)鍵。提高ctDNA分析質(zhì)量需考慮的重要因素之一是血液樣品預(yù)分析處理，目前ctDNA分離程序涉及將血液樣品送到實驗室，通過離心分離血漿和從血漿中純化ctDNA，程序復(fù)雜且耗時，且需對樣品進(jìn)行強烈處理，這可能導(dǎo)致ctDNA降解或血細(xì)胞溶解引起基因組釋放，從而對樣本造成污染。檢測ctDNA的血液樣本可通過含有獨特抗凝劑和細(xì)胞穩(wěn)定劑的特殊采血管進(jìn)行采集、運輸和保存，但在抽血后如能立即進(jìn)行ctDNA純化，最大限度地縮短處理樣品和純化所需總時間，將有利于進(jìn)一步提高ctDNA分析質(zhì)量，包括濃度和含量。ctDNA檢測能否成為實現(xiàn)腫瘤早期篩查的特異性生物標(biāo)記物取決于更高靈敏度的ctDNA濃度檢測技術(shù)的發(fā)現(xiàn)。目前關(guān)于ctDNA的檢測尚缺乏統(tǒng)一的行業(yè)質(zhì)控檢測標(biāo)準(zhǔn)，而對罕見變異的臨床界定也仍需大量臨床信息積累，同時測序技術(shù)的高成本及結(jié)果的解讀還有待于完善等，這些都是現(xiàn)階段ctDNA檢測分析所面臨的挑戰(zhàn)。

4 展望

目前我們對cfDNA釋放和清除機制的理解有限，不清楚不同部位腫瘤細(xì)胞釋出的ctDNA或同一部位腫瘤的不同亞克隆體釋出的ctDNA的種類、性質(zhì)和數(shù)量是否與總ctDNA池（即血液中所有的ctDNA）呈現(xiàn)出正相關(guān)？腫瘤血管分布和代謝特性是否會影響ctDNA在血流中的分布？但現(xiàn)有研究充分表明ctDNA可能是藥物開發(fā)、腫瘤異質(zhì)性和克隆進(jìn)化研究的有利研究工具。

ctDNA的臨床應(yīng)用將取決于患者和臨床醫(yī)生的實際情況、所需基礎(chǔ)設(shè)施及其成本效益。組織活檢對于癌癥的組織學(xué)診斷來說依然是“金標(biāo)準(zhǔn)”。2016年，美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)了血漿突變檢測試劑的應(yīng)用，而新興的ctDNA突變檢測臨床試驗也在積極進(jìn)行，這是個性化腫瘤學(xué)檢測的里程碑，表明ctDNA檢測目前正在擴大臨床應(yīng)用，以使患者更大程度地受益。進(jìn)一步探索ctDNA的生物學(xué)特性，改進(jìn)技術(shù)使腫瘤無創(chuàng)分子分析的范圍越來越廣，為基因組研究開辟新途徑，這將有助于大大提高臨床診療的決策水平。