何爽 黃萍 范明娟

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是臨床常見疾病，其中2型糖尿病是主要病理類型，而糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是2型糖尿病的主要并發(fā)癥之一，DN早期癥狀較為隱匿，目前尚缺乏有效診斷指標(biāo)［1-3］。因而積極尋找分子標(biāo)志物對2型糖尿病腎病的診斷及改善患者預(yù)后具有重要臨床意義。微小RNA（microRNA，miRNA）是一種內(nèi)源性非編碼小RNA分子，并可通過調(diào)控下游靶基因表達(dá)而參與多種生理病理過程，研究表明部分miRNA異常表達(dá)與2型糖尿病腎病發(fā)生過程密切相關(guān)，并可能作為診斷早期糖尿病腎病的分子標(biāo)志物［4］。但miRNA診斷2型糖尿病腎病存在一定假陽性或假陰性，因而需積極探尋miRNA分子并分析其對2型糖尿病腎病的診斷價(jià)值。相關(guān)報(bào)道指出微小 RNA-192（microRNA-192，miR-192）在 DN患者血清中呈低表達(dá)，并可能調(diào)控DN發(fā)生發(fā)展過程［5］。研究表明微小RNA-29c（microRNA-29c，miR-29c）可通過調(diào)控靶基因Sprouty homolog 1表達(dá)而促進(jìn)糖尿病腎病發(fā)展，抑制miR-29c的表達(dá)可減緩糖尿病腎病的進(jìn)展［6］。但miR-192與miR-29c對2型糖尿病腎病的診斷價(jià)值尚未可知。尿中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL）可參與多種腎臟疾病的發(fā)生及發(fā)展過程，并可作為反映急性腎損傷的重要指標(biāo)［7-8］。本研究主要探討血漿 miR-192、miR-29c與NGAL的相關(guān)性，分析血漿miR-192與miR-29c聯(lián)合檢測對2型糖尿病腎病的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2017年12月至2018年12月本院收治的166例2型糖尿病患者為研究對象，所有患者均符合糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］。Ⅱ型糖尿病患者符合下列任何一項(xiàng)者：①大量白蛋白尿；②糖尿病視網(wǎng)膜病變伴微量蛋白尿即診斷為Ⅱ型糖尿病腎?。?0］。其中DM組患者尿微量清蛋白/Crea低于30 mg/gCrea，DN組患者尿微量清蛋白/Crea處于30～300 mg/gCrea之間［11］。同時(shí)以本院同時(shí)期健康體檢人群60例為NC組。DM組患者年齡為68～75歲，平均年齡為（71.35±6.13）歲；DN組患者年齡為62～76歲，平均年齡為（72.35±4.49）歲；正常組年齡為66～76歲，平均年齡為（70.32±5.31）歲。所有患者知情且簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并內(nèi)分泌、心血管等疾病患者；原發(fā)性腎病、腎動脈狹窄等疾病患者；心臟與肝臟等全身疾病引發(fā)的腎臟疾病患者。各組研究對象年齡、性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 采集樣本

所有研究對象均于入組后空腹12 h，取清晨靜脈血5 mL置于EDTA抗凝管，4℃條件下，2 500 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，分離血漿，吸取血漿置于1.5 mL EP管內(nèi)，置于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 主要試劑與儀器

miRNAcute miRNA提取分離試劑盒、miRNAcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、熒光定量檢測試劑盒均購自廣州真知生物有限公司；尿中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL）檢測試劑盒購自福建邁新生物技術(shù)有限公司。ABI 7500型熒光定量PCR儀購自北京拓普塞斯生物技術(shù)有限公司。

1.2.3 時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Quantitative Realtime PCR，qRT-PCR）檢測血漿 miR-192、miR-29c的表達(dá)水平

采用miRNAcute miRNA提取分離試劑盒分離并提取RNA，按照miRNAcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，參照熒光定量檢測試劑盒進(jìn)行熒光定量檢測，其中U6為內(nèi)參，正向引物為5′-ATTGGAACGATACAGAGAA-GATT-3′，反向引物為：5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′；miR-192 正向引物為 5′-GGGGCTGACCTATGAATTGA-3′，反向引物為：5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；miR-29c正 向 引 物 為5′-GTAGCACCATTTGAAATCAG-3′，反向引物為：5′-TTGGCACTAGCACATT-3′。反應(yīng)體系：cDNA 2.0 μL，Primer 1.0 μL，RNase H2O 7 μL，SYBR Primix Ex TaqTM10 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 2 min，95℃變性 15 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共循環(huán) 40 次。采用 2-ΔΔCt法計(jì)算 miR-192、miR-29c的相對表達(dá)量。

1.2.4 臨床指標(biāo)

所有研究對象均留取清晨中段尿5 mL，室溫條件下，3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，吸取上清置于EP管內(nèi)，-80℃條件下凍存。采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測尿中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（NGAL）水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.5 結(jié)果判定

根據(jù)糖尿病腎病臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，2型糖尿病患者糖尿病無腎損害組（DM組）86例與糖尿病腎病組（DN組）80例。采用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic，ROC）分析血漿miR-192、miR-29c表達(dá)對2型糖尿病腎病的診斷價(jià)值，根據(jù)臨床檢測結(jié)果比較分析血漿miR-192、miR-29c診斷2型糖尿病腎病的效能分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 21.0進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析；ROC分析血漿miR-192、miR-29c表達(dá)對2型糖尿病腎病的診斷價(jià)值；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，各組數(shù)據(jù)均以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組一般資料比較

與正常組比較，DM組與DN組患者空腹血糖均顯著升高（P＜0.05），DN組顯著高于DM組（P＜0.05）；相較于正常組，DM組與DN組患者尿NGAL均顯著升高（P＜0.05），DN組顯著高于DM組（P＜0.05），而各組研究對象性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)等比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組一般資料比較（±s）Table 1 Comparison of general data of each group（±s）

表1 各組一般資料比較（±s）Table 1 Comparison of general data of each group（±s）

與NC組相比，*P＜0.05；與DM組相比，#P＜0.05。

組別NC組DM組DN組F/χ2 P值n 60 86 80男/女38/22 53/33 50/30 0.044 0.978年齡（歲）61.32±8.31 61.35±8.13 62.35±6.49 0.454 0.636空腹血糖（mmol/L）4.32±0.32 7.96±1.59*8.52±1.52*#49.238 0.000尿NGAL（μg/L）8.31±1.21 16.58±3.12*39.57±6.58*#988.014 0.000體質(zhì)指數(shù)（kg/m2）26.58±3.25 26.45±3.21 26.47±3.35 0.031 0.970

2.2 各組血漿miR-192、miR-29c表達(dá)水平比較

與NC組相比，DM組與DN組患者血漿miR-192的表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05），DN組顯著低于DM組（P＜0.05）；相對于NC組，DM組與DN組患者血漿miR-29c的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），DN組顯著高于DM組（P＜0.05），見表2。

2.3 血漿miR-192、miR-29c表達(dá)與DN患者NGAL的相關(guān)性分析

采用Pearson法分析DN患者血漿miR-192、miR-29c表達(dá)水平與尿NGAL的相關(guān)性，結(jié)果顯示，miR-192與尿NGAL呈負(fù)相關(guān)（r=-0.338，P=0.002），miR-29c與尿NGAL呈正相關(guān)（r=0.516，P=0.000），見圖1。

表2 各組血漿miR-192、miR-29c表達(dá)水平比較（±s）Table 2 Comparison of plasma miR-192 and miR-29c expression levels in each group（±s）

表2 各組血漿miR-192、miR-29c表達(dá)水平比較（±s）Table 2 Comparison of plasma miR-192 and miR-29c expression levels in each group（±s）

組別NC組DM組DN組F值P值n 60 86 80 miR-192 1.00±0.09 0.62±0.15*0.31±0.02*#751.971＜0.001 miR-29c 1.01±0.13 2.16±0.24*3.22±0.57*#597.004＜0.001

2.4 血漿miR-192、miR-29c對2型糖尿病腎病的診斷價(jià)值

圖1 血漿miR-192、miR-29c表達(dá)與DN患者NGAL的相關(guān)性分析Figure 1 Correlation analysis between plasma miR-192 and miR-29c expression and NGAL in patients with DN

ROC分析血漿miR-192對Ⅱ型糖尿病腎病的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示miR-192診斷2型糖尿病腎病的靈敏度為52.50%，特異度為75.58%，AUC為0.679，95%CI：0.602～0.749，截?cái)嘀禐?.40，見圖2A。ROC分析血漿miR-29c對Ⅱ型糖尿病腎病的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示miR-29c診斷2型糖尿病腎病的靈敏度為50.00%，特異度為86.05%，AUC為0.796，95%CI：0.726～0.854，截?cái)嘀禐?.94，見圖2B。

圖2 ROC分析血漿miR-192、miR-29c對Ⅱ型糖尿病腎病的診斷價(jià)值Figure 2 ROC analysis of the value of plasma miR-192 and miR-29c in the diagnosis of type 2 diabetic nephropathy

2.5 聯(lián)合檢測對2型糖尿病腎病的診斷價(jià)值

聯(lián)合檢測時(shí)，診斷靈敏度為97.50%，特異度為95.34%，準(zhǔn)確度為96.39%，見表3。miR-29c對2型糖尿病腎病的診斷特異度高于miR-192，聯(lián)合檢測時(shí)靈敏度與準(zhǔn)確度均高于單項(xiàng)檢測（P＜0.05），見表3、表4。

3 討論

2型糖尿病是一種內(nèi)分泌代謝性疾病，機(jī)體長時(shí)間處于高血糖狀態(tài)可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放內(nèi)皮血管活性物質(zhì)從而促使腎小球硬化導(dǎo)致糖尿病腎病的發(fā)生［12］。糖尿病腎病是糖尿病微血管并發(fā)癥，臨床主要通過檢測微量尿蛋白診斷糖尿病腎病，由于微量尿蛋白受多種因素的影響導(dǎo)致其對腎損傷程度的診斷缺乏特異性［13］。因而尋找敏感、特異且無創(chuàng)性的指標(biāo)診斷2型糖尿病腎病具有重要意義。研究表明miRNA在糖尿病患者血清中異常表達(dá)并可能作為診斷糖尿病腎病的有效指標(biāo)［14］。因此本研究積極探尋與2型糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的miRNA，進(jìn)一步分析其對2型糖尿病腎病的診斷價(jià)值。

表3 miR-29c和miR-192聯(lián)合檢測對Ⅱ型糖尿病腎病的診斷價(jià)值Table 3 Diagnostic value of combined detection of miR-29c and miR-192 in type 2 diabetic nephropathy

表4 miR-29c和miR-192聯(lián)合檢測與單項(xiàng)檢測對Ⅱ型糖尿病腎病的診斷價(jià)值分析Table 4 Diagnostic value of combined detection and single detection of miR-29c and miR-192 in type 2 diabetic nephropathy

miR-192在成人心臟手術(shù)后急性腎損傷血漿中的表達(dá)水平異常，并可作為急性腎損傷的早期診斷標(biāo)志物［15］。miR-192在2型糖尿病腎病患者中的表達(dá)水平降低且伴隨尿白蛋白肌酐比值（UACR）的降低，miR-192低表達(dá)與腎臟纖維化密切相關(guān)［16］。研究表明miR-192通過靶向早期生長反應(yīng)因子 1（Egr1）的表達(dá)影響 DN 的進(jìn)展［17］。本研究結(jié)果顯示2型糖尿病腎病患者血漿中miR-192的表達(dá)水平顯著降低，提示miR-192表達(dá)下調(diào)可能參與2型糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展過程。本研究結(jié)果顯示2型糖尿病患者尿NGAL水平顯著高于正常組，而2型糖尿病腎病患者尿NGAL水平顯著高于DM組，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)2型糖尿病腎病患者中miR-192表達(dá)與尿NGAL水平呈負(fù)相關(guān)，說明NGAL可反應(yīng)2型糖尿病腎病患者腎功能損傷狀況，腎小管損害可引起血漿miR-192的低表達(dá)。提示miR-192表達(dá)下調(diào)可能促進(jìn)疾病進(jìn)展并損害腎小球及內(nèi)皮細(xì)胞功能。沉默miR-29c可能通過AMPK/mTOR信號抑制糖尿病腎病腎纖維化，并可能作為治療糖尿病腎病腎纖維化的有效靶點(diǎn)［18］。miR-29c在狼瘡性腎炎患者中呈高表達(dá)，還可作為狼瘡性腎炎早期腎纖維化的預(yù)測因子［19］。研究表明miR-29c還可作為診斷HTLV-1感染的新型潛在生物標(biāo)志物［20］。本研究結(jié)果顯示2型糖尿病患者血漿中miR-29c的表達(dá)水平顯著升高，且DN組顯著高于DM組，提示隨著miR-29c表達(dá)水平的升高可促進(jìn)2型糖尿病腎病的發(fā)生及發(fā)展。

基于以上研究結(jié)果，本研究結(jié)果顯示2型糖尿病腎病患者中miR-29c與NGAL水平呈正相關(guān)，提示miR-29c與NGAL在2型糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展過程中可能存在一定正向調(diào)控作用。目前關(guān)于miRNA與2型糖尿病腎病診斷的研究較多，但關(guān)于miR-29c、miR-192聯(lián)合檢測對2型糖尿病腎病的診斷價(jià)值尚未見報(bào)道，本研究采用ROC分析血漿miR-192、miR-29c表達(dá)對2型糖尿病腎病的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示miR-192對2型糖尿病腎病的診斷靈敏度與特異度較低，而miR-29c對2型糖尿病腎病的診斷靈敏度與特異度高于miR-192，進(jìn)一步采用聯(lián)合檢測，結(jié)果顯示聯(lián)合檢測顯著高于單項(xiàng)檢測。提示聯(lián)合血漿miR-192、miR-29c表達(dá)水平檢測可顯著提高2型糖尿病腎病的診斷效率及準(zhǔn)確率。

綜上所述，血漿miR-192、miR-29c聯(lián)合檢測2型糖尿病腎病具有較高的診斷效能，可能成為2型糖尿病腎病的診斷指標(biāo)。但血漿miR-192、miR-29c與微量尿蛋白指標(biāo)的比較仍需進(jìn)一步研究，關(guān)于miR-192、miR-29c與NGAL在2型糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制仍需深入研究。