采用還原劑-甲酸法溶解制備羊毛角蛋白質溶液

李 博， 姚金波， 牛家?guī)V， 王 樂， 馮 懋， 孫艷麗

(1. 天津工業(yè)大學 紡織科學與工程學院， 天津 300387； 2. 武漢紡織大學 化學與化工學院， 湖北 武漢 430073；3. 武漢紡織大學 湖北省生物質纖維與生態(tài)染整重點實驗室， 湖北 武漢 430073)

羊毛是一種性能優(yōu)良的天然蛋白質纖維材料，其制品被越來越廣泛地應用于生活和生產(chǎn)中；但羊毛的產(chǎn)量十分有限，尤其是優(yōu)質羊毛，同時廢棄的羊毛制品無法被有效地再次利用，造成寶貴資源的浪費。為此，對羊毛纖維進行回收再生利用顯得至關重要。羊毛的主要組成物為角蛋白質，通過溶解后再生的方法可獲得較純凈的蛋白質材料，其具有優(yōu)良的生物活性、生物相容性以及可降解性能，可應用于醫(yī)學、生物和紡織等眾多領域[1]。

溶解羊毛纖維制備角蛋白質溶液是研究蛋白質再生應用的前提條件，角蛋白質質溶液性能的優(yōu)劣決定了再生材料的利用價值。目前研究應用較多的制備角蛋白質溶液的方法包括氧化法、還原法以及離子液體法等。孫艷麗等[2]采用巰基乙醇與離子液體1-烯丙基-3-甲基咪唑氯鹽([AMIM]Cl)在120 ℃條件下共同溶解羊毛纖維獲得角蛋白質溶液，溶液中蛋白質的分子質量主要分布在14.4、31、43、66.2 ku處。張恒等[3]分別采用還原C法和離子液體法對羊毛纖維進行溶解。其中：還原C法是采用亞硫酸氫鈉、尿素、硫脲和十二烷基磺酸鈉對羊毛進行溶解，在95 ℃條件下溶解6 h，溶解率可達到87%；而離子液體法采用[AMIM]Cl試劑對羊毛進行溶解，溶解率僅有10%。Shavandi等[4]將羊毛纖維溶解于質量分數(shù)為24%的過氧乙酸溶液中，在常溫條件下溶解2 d后可分別提取獲得水溶性角蛋白質(提取率為57%)和不溶性角蛋白質(提取率為40%)，其中不溶性角蛋白質含有更多的化學基團。

如何在獲得較高溶解率的基礎上不過度破壞蛋白質大分子鏈的完整性，是制備性能優(yōu)良的角蛋白質溶液的關鍵。目前大部分研究者在制備蛋白質再生材料時需先將蛋白質從溶解體系中提取出來，再溶解于甲酸[5]或者碳酸鈉緩沖溶液[6]等適于再生工藝的試劑中。這不但使得再生材料制備工序更加復雜，也使角蛋白質在二次溶解中被進一步破壞，影響再生材料的性能。為解決以上溶解方法存在的問題，首先使用弱還原劑三羥基有機磷化合物(LKS-610)破壞羊毛纖維中大分子間的二硫鍵，再利用甲酸試劑的強酸性和其能夠有效溶解細胞間質使纖維劇烈溶脹的特性[7-8]，達到對羊毛纖維的溶解效果。本文采用單因素分析方法研究了羊毛纖維的溶解工藝，根據(jù)溶液的纖維溶解率、黏度和蛋白質分子質量分布變化確定最優(yōu)的角蛋白質溶液制備方法。

1 實驗部分

1.1 材料與設備

原料：羊毛纖維(直徑為23～25 μm，澳洲羊毛，浙江新澳紡織股份有限公司)；透析袋(截留分子質量為8～14 ku，北京市檸檬專業(yè)實驗器材有限責任公司)。

試劑：三羥基有機磷還原劑(LKS-610，質量分數(shù)為40%)，分析純，天津市綠源天美科技有限公司；甲酸(質量分數(shù)為88%)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、β-巰基乙醇(質量分數(shù)為99%)、鹽酸(質量分數(shù)為37%)、冰醋酸、無水乙醇，分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；蛋白質標準樣(分子質量為14.4～94.0 ku)，北京天根生化科技有限公司；甘氨酸，分析純，天津市鼎盛鑫化工有限公司；考馬斯亮藍R250，分析純，南京奧多福尼生物試劑有限公司。

設備：HZS-H型恒溫振蕩水浴鍋，哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；BA2000型光學顯微鏡，天津市二十八中儀器廠；DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠；CVOD100型馬爾文旋轉流變儀，英國馬爾文儀器有限公司；L8900型氨基酸分析儀，日本日立有限公司。

1.2 羊毛溶解工藝

1.2.1還原劑預處理羊毛纖維

將1 g洗凈的羊毛浸泡于體積為10 mL的LKS-610試劑中，于80 ℃水浴鍋中處理30～60 min，處理結束后濾去纖維體系中多余的整理劑，烘干待用。通過LKS-610試劑對羊毛中二硫鍵高效的破壞作用，獲得在還原體系中富含自由巰基的待溶解羊毛試樣。

1.2.2甲酸溶解羊毛纖維

采用單因素實驗方法對甲酸制備角蛋白質溶液的工藝方法進行研究，將一定質量的經(jīng)LKS-610預處理后的羊毛纖維加入到質量分數(shù)為88%的甲酸溶液中，分別以纖維質量、溶解溫度和溶解時間作為單因素變量，以羊毛纖維的溶解率、黏度和角蛋白質溶液中蛋白質分子質量為分析依據(jù)，考察不同條件下的溶解效果。

1.3 測試方法

1.3.1羊毛纖維氨基酸含量測試

準確稱取一定量的羊毛纖維試樣(200 mg)置于水解管中，加入10 mL鹽酸(濃度為6 mol/L)，用酒精噴燈封閉水解管后置于110 ℃烘箱中水解24 h，待試樣完全水解后取出冷卻并打開水解管。將水解樣品過濾后定容，吸取2 mL定容后的樣品，置于真空脫酸儀上脫酸(溫度為60 ℃)至干燥，底部留有少許固體或痕漬為止。向脫酸后的樣品中加入2 mL緩沖液(質量分數(shù)分別為2%的無水檸檬酸鈉，1%的鹽酸，0.5%的硫代二乙醇，0.1%的苯甲酸溶液)，置于振蕩混合器上混合均勻，然后利用針管吸取少量，通過孔徑為0.22 μm的過濾器過濾后，采用氨基酸分析儀進行測試。

長。但事實是： Boysen-Jensen(1913)的真實實驗得出的結論是： 當云母片從背光側插入時，胚芽鞘喪失向光性，幼苗依然會直立生長；而當云母片從向光側插入時，胚芽鞘才向光彎曲[2]。分析可能的原因是： 雖然背光側的生長素含量要高于向光側，卻因云母片阻礙而無法向下運輸，同時向光側的生長抑制物質的含量多于背光一側[3]，所以兩側的生長速度相同，幼苗直立生長。

1.3.2纖維在甲酸溶液中的溶解狀態(tài)觀察

為比較LKS-610預處理對甲酸溶解羊毛纖維效果的影響，以及研究羊毛纖維在甲酸溶液中的溶解狀態(tài)，分別取未處理和LKS-610預處理后的羊毛纖維各1 g，浸沒于20 mL的甲酸溶液中，在60 ℃水浴鍋中進行攪拌溶解。溶解過程中，每間隔60 min取少量纖維試樣置于載玻片上，用光學顯微鏡進行觀察。

1.3.3纖維溶解率測試

羊毛纖維在甲酸溶液體系中溶解完成后，對溶液體系進行抽濾，分別稱量過濾前后干燥濾紙的質量，記為m1、m2。溶解前羊毛的質量為m，則溶解率K的計算公式為

1.3.4凝膠電泳測試

由于本文制備的角蛋白質溶液中含有甲酸，其強酸性會對電泳膠體產(chǎn)生破壞，影響凝膠電泳的測試結果，因此，測試前需先通過透析得到純角蛋白質粉末，再對其進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳測試。其中：分離膠質量分數(shù)為12%；濃縮膠質量分數(shù)為5%；加樣10 μL，測試電壓為80 V。電泳完成后，對試樣進行染色、脫色、水洗等處理后拍照記錄。

1.3.5角蛋白質溶液黏度測試

采用馬爾文旋轉流變儀對離心過濾后的澄清角蛋白質溶液進行黏度測試，并且在測試前保證待測溶液的質量分數(shù)一致。設置測試溫度為25 ℃，剪切應力恒定為60 Pa，實驗夾具采用錐角為4°、直徑為40 mm的錐板。

2 結果與討論

2.1 預處理后纖維的氨基酸含量變化分析

表1 LKS-610處理羊毛纖維試樣的氨基酸含量測試結果Tab.1 Amino acid content test results of wool fiber samples

由表1可看出：羊毛纖維經(jīng)過還原劑LKS-610處理30 min后，胱氨酸的質量分數(shù)由10.09%驟降至1.55%；繼續(xù)延長處理時間，質量分數(shù)的減小變緩。由此說明預處理過程中纖維內大部分的二硫鍵被還原斷開并以其他形式存在[9]，與文獻[10-11]報道相比，還原劑LKS-610在相對一致的條件下對二硫鍵的破壞作用更加有效。同時，從表1中可發(fā)現(xiàn)，其他種類的氨基酸含量并沒有明顯減少，證明LKS-610對二硫鍵的作用效果具有一定的專一性。選擇在80 ℃條件下處理60 min作為還原劑LKS-610預處理羊毛纖維的最優(yōu)工藝，進一步研究預處理后纖維在甲酸溶液中的溶解狀態(tài)。

2.2 預處理纖維在甲酸溶液中的溶解狀態(tài)

圖1、2示出LKS-610預處理前后羊毛纖維在甲酸溶液中溶解不同時間后的光學顯微鏡照片。

圖1 未處理羊毛纖維在不同甲酸溶解時間下的溶解狀態(tài)Fig.1 Dissolving state of untreated wool fibers in formic acid solution under different dissolution time

圖2 LKS-610處理后羊毛纖維在不同甲酸溶解時間下的溶解狀態(tài)Fig.2 Dissolving state of LKS-610 treated wool fibers in formic acid solution under different dissolution time

從圖1可以看出：溶解1 h后羊毛纖維的外觀和形態(tài)并未發(fā)生明顯的變化；溶解時間達到2 h時，纖維的鱗片層發(fā)生了部分的翹起和脫落，纖維的主體也有一定程度的溶脹；繼續(xù)延長處理時間，纖維結構在甲酸作用下發(fā)生破壞并逐漸分解為纖維殘片和細胞、巨原纖結構單元[8](見圖1(c)、(d))。從圖2可以發(fā)現(xiàn)：預處理過的羊毛纖維在甲酸溶液中溶解1 h后發(fā)生了明顯的溶脹，同時有部分原纖結構從纖維主體脫離出來；溶解2 h后，纖維的主體結構在甲酸作用下被顯著破壞；當溶解時間達到3 h后，已有部分纖維被溶解，圖中深色的團聚部分便是被溶解的羊毛纖維；繼續(xù)溶解更長時間后，大部分的纖維均已被破壞溶解，僅有部分纖維殘渣存在于溶液體系中。

由以上分析可以發(fā)現(xiàn)，羊毛纖維在甲酸溶液中雖然發(fā)生了結構的分解和破壞，但仍保持一定的細胞結構體，由此證明甲酸溶液無法達到單獨溶解羊毛纖維的效果，它對羊毛纖維的作用主要體現(xiàn)在溶解細胞間質從而溶脹纖維和分解纖維結構。而經(jīng)LKS-610處理后纖維便可較好地溶解于甲酸溶液中，這是由于前期研究證明LKS-610能夠有效破壞羊毛中的二硫鍵，減小了蛋白質大分子間的作用力，再通過甲酸溶液的強酸性和溶解細胞間質的能力使得羊毛纖維被有效溶解，因此，LKS-610預處理過程對于甲酸溶解羊毛纖維顯得尤為重要，通過LKS-610試劑和甲酸的共同作用可達到有效溶解羊毛纖維的效果。

2.3 甲酸溶解羊毛纖維的優(yōu)化工藝

2.3.1甲酸試劑對不同質量羊毛纖維的溶解效果

分別取不同質量的羊毛纖維(3、4、5、6 g)溶解于體積為100 mL的甲酸溶液(質量分數(shù)為88%)中，研究甲酸試劑對不同質量羊毛纖維的溶解效果。溶解溫度為60 ℃，溶解時間為5 h。表2示出不同質量纖維的溶解率和角蛋白質溶液剪切黏度變化。

表2 不同質量羊毛纖維在甲酸中的溶解率和溶液黏度變化Tab.2 Dissolution rate and viscosity changes of wool with different mass dissolved in formic acid

從表2可以看出：隨著溶解羊毛纖維質量的增加，角蛋白質溶液的溶解率逐漸降低。當羊毛質量為6 g時，溶解率下降明顯，溶解體系呈凝膠狀態(tài)，已無法測試溶液的溶解率和黏度。溶解率的降低主要是由于一定質量的甲酸溶液對羊毛纖維的溶解能力有限，而未溶解的物質為羊毛纖維內的高硫部分，這部分中含有大量二硫鍵，極難溶解而易于呈現(xiàn)凝膠狀態(tài)[12]。當置于甲酸溶液中的羊毛過多時，甲酸將難以使纖維充分溶脹進而溶解，因此，當羊毛質量達到6 g時，羊毛的溶解率大幅降低。角蛋白質溶液的黏度變化則是由于溶解于甲酸溶液中的角蛋白質含量有所增加，在假設蛋白質大分子舒展狀態(tài)相同的情況下，則體系的黏度隨角蛋白質含量的增加而增大。由于本文實驗中不同溶液的溶解浴比無法一致，因此，黏度測試結果不能作為分子質量大小的判斷依據(jù)。

圖3示出SDS-PAGE凝膠電泳的測試結果。可以看出：4組試樣的蛋白質分子質量分布大致相同，主要分布在45～66 ku、20～33 ku、14.4～20 ku這3個范圍內。羊毛纖維質量為6 g時，試樣是取凝膠狀物質進行制樣和測試，其中含有部分未完全溶解的纖維，因此，實際參與電泳測試過程的蛋白質較少，其對應的電泳條帶染色后顏色較淺。對比文獻[13-14]報道中角蛋白質溶液的分子質量分布結果可以證實，采用本文方法溶解羊毛能夠獲得具有較高分子質量的角蛋白質溶液，同時也說明羊毛纖維溶解于甲酸溶液中的質量百分比對溶解后蛋白質分子質量分布影響不大。綜上所述，羊毛纖維在100 mL甲酸中溶解效果最佳時的質量為5 g。

a為標準蛋白質譜帶；b～e分別為纖維質量等于3、4、5、6 g的試樣的電泳譜帶。圖3 不同溶解纖維質量下試樣的SDS-PAGE凝膠電泳測試結果Fig.3 SDS-PAGE gel electrophoretogram of samples with different disolved mass fraction

2.3.2溫度對溶解效果的影響

在確定羊毛質量為5 g，甲酸溶液質量分數(shù)為88%、體積為100 mL，溶解時間為5 h的條件下，分析不同溶解溫度對溶解效果的影響規(guī)律，結果如表3所示。

表3 不同溶解溫度下纖維的溶解率和溶液黏度變化Tab.3 Dissolution rate and viscosity change of samples at different dissolved temperatures

由表3看出：纖維在甲酸中的溶解率隨著溶解溫度的升高而逐漸提升；溶解溫度在20～40 ℃時，纖維溶解率較低且變化不大；當溶解溫度達到50 ℃以后，溶解率由56.3%升高到63.5%；而溶解溫度為80 ℃時，纖維的溶解率高達80.6%。說明當溫度達到一定程度后，羊毛纖維在甲酸溶液中會更容易和快速地發(fā)生溶脹分解，同時伴隨著蛋白質大分子結構的降解和破壞，纖維溶解率得到顯著提升。從表3還可看出：蛋白質溶液的黏度變化則是隨著溶解溫度的升高呈現(xiàn)出先增大后減小的規(guī)律；當溶解溫度為50 ℃時，溶液體系的黏度達到最大值。這是因為當溫度由20 ℃升高為50 ℃的過程中，溶液中溶解的羊毛纖維含量越來越多，蛋白質含量的增加使溶液的黏度逐漸增大；當溶解溫度超過60 ℃以后，角蛋白質溶液的黏度下降明顯，這顯然與高溫導致大分子酸性降解有關。

圖4示出不同試樣的凝膠電泳測試結果?？梢钥闯觯喝芙鉁囟葹?0、30、40 ℃時，試樣的分子質量主要分布于較高的位置，在45.0～66.2 ku范圍內有較為明顯的條帶，而在低分子質量位置除了14.4 ku及以下處有分布外，其他位置幾乎沒有分布；溶解溫度為50、60 ℃時，蛋白質大分子主要分布于45、33、26 ku，說明隨著溫度升高，蛋白質大分子出現(xiàn)一定程度的降解；當溫度提升至80 ℃時，蛋白質分子幾乎都聚集于電泳譜帶的底端，進一步說明溫度過高會導致蛋白質分子在甲酸溶液中劇烈降解。綜上所述，50 ℃是羊毛纖維比較適宜的溶解溫度。

a1為標準蛋白質譜帶；b1～h1分別為溶解溫度為20、30、40、50、60、70、80 ℃時試樣的電泳譜帶。圖4 不同溶解溫度下試樣的SDS-PAGE凝膠電泳測試結果Fig.4 SDS-PAGE gel electrophoretogram of samples at different dissolved temperatures

2.3.3溶解時間對溶解效果的影響

在確定羊毛質量為5 g，溶解溫度為50 ℃的條件下，考察溶解時間對溶解效果的影響。選取處理時間分別為3、4、5、6 h進行測試分析，結果如表4和圖5所示。

表4 不同溶解時間下纖維的溶解率和溶液黏度變化Tab.4 Dissolution rate and viscosity change of samples under different dissolving time

a2為標準蛋白質譜帶；b2～e2分別為纖維溶解時間為3、4、5、6 h后試樣的電泳譜帶。圖5 不同溶解時間下試樣的SDS-PAGE凝膠電泳測試結果Fig.5 SDS-PAGE gel electrophoretogram of samples under different dissolved time

由表4看出，隨著溶解時間的延長，羊毛纖維的溶解率顯著提高，而溶液體系的黏度則有所降低，顯然過長的溶解時間會使蛋白質大分子降解嚴重。由圖5可以看出：隨著溶解時間的延長，角蛋白質的分子質量分布逐漸減小；纖維溶解時間為3～6 h的4組測試樣譜帶在分子質量為66.2、20、14.4 ku 3處都有明顯的分布；溶解時間為3 h試樣的分子質量較多地分布在66.2 ku附近，甚至分子質量更大；溶解時間為4 ～5 h的試樣分子質量分布比較相近，66.2 ku范圍的分子質量分布較溶解3 h試樣較少，在20～26 ku范圍內的分子質量分布則有所增多，證明隨著溶解時間的延長，蛋白質大分子在甲酸溶液中有所降解；當溶解時間達到6 h后，在20 ku范圍附近出現(xiàn)多條條帶，且小于14.4 ku處的條帶顏色也較深，由此說明溶解時間達到6 h后角蛋白質大分子鏈降解嚴重，這與黏度的測試分析一致。綜合溶解率、黏度以及凝膠電泳的測試結果，確定5 h是較為理想的溶解時間。

通過對以上單因素實驗結果的分析，獲得甲酸溶液溶解預處理后羊毛纖維的最佳工藝：羊毛纖維質量為5 g，甲酸質量分數(shù)為88%、體積為100 mL，溶解溫度50 ℃，溶解時間為5 h。溶解后獲得的角蛋白質溶液具有較高的溶解率，同時也保證其具有較高的分子質量分布。

2.4 角蛋白質溶液的穩(wěn)定性

由于質量分數(shù)為88%的甲酸具有強酸性，需要進一步驗證溶解制備的角蛋白質溶液中蛋白質多肽大分子是否會在放置過程中發(fā)生嚴重的降解，因此，本文研究中采用上述優(yōu)化工藝溶解制得羊毛角蛋白質溶液并靜置于常溫環(huán)境中，每隔一定時間取部分溶液透析獲得再生蛋白質，測試分子質量的變化以表征溶液的穩(wěn)定性，結果如圖6所示。

a3為標準蛋白質譜帶；b3～f3分別為角蛋白質溶液靜置0、1、3、7、14 d后試樣的電泳譜帶。圖6 羊毛角蛋白質溶液室溫下靜置不同時間后的分子質量分布Fig.6 Molecular weight distribution of keratin solution after standing at room temperature for different time periods

由圖6看出，5條不同試樣的電泳譜帶中蛋白質的分子質量分布大致相同，分別在45.0、26.0、14.4 ku處出現(xiàn)較明顯的分布條帶，與溶解工藝優(yōu)化實驗的分子質量分布結果基本一致。試樣b3～e3電泳譜帶無明顯區(qū)別，而靜置14 d的試樣f3中在33.0 ku處以下位置的顏色加深且條帶模糊變粗，說明溶液中小分子質量的蛋白質含量有所增加，角蛋白質在甲酸溶液中發(fā)生了一定程度的降解，但分子質量整體分布變化不大。通過以上實驗證明，本文研究中采用甲酸溶解制備的羊毛角蛋白質溶液具有較好的穩(wěn)定性，在常溫環(huán)境下不會由于強酸性導致溶液中的蛋白質大分子快速降解，具有一定的實際應用價值。

3 結 論

1)甲酸可溶解羊毛纖維內的細胞間質使其結構被破壞而分解，但無法達到溶解纖維的效果，而經(jīng)還原劑LKS-610預處理后羊毛纖維可快速有效地溶解于甲酸溶液中。

2)質量分數(shù)為88%的甲酸溶液對預處理后的羊毛纖維溶解的最優(yōu)工藝為：羊毛纖維質量5 g，甲酸溶液體積100 mL，溶解溫度50 ℃，溶解時間5 h。在此條件下，可獲得溶解率為65%左右，分子質量主要集中在40～60 ku、26 ku和14.4 ku，具有較高分子質量的羊毛角蛋白質溶液。

3)制備的羊毛角蛋白質溶液在常溫環(huán)境中具有一定的穩(wěn)定性，溶液內的蛋白質多肽不會發(fā)生快速的降解，具有一定的應用價值。

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