危 敏，余海浪，王涵多，雷 潔，韓璐好

(1.深圳市南山區(qū)婦幼保健院檢驗(yàn)科遺傳室，廣東 深圳 518054；2.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，廣東 廣州 510515)

宮頸癌是女性高發(fā)的惡性腫瘤，其發(fā)生一般需經(jīng)歷從正常宮頸上皮到不同級(jí)別癌前病變的過程，平均需要5～20年。高危型人乳頭狀瘤病毒(HR-HPV)持續(xù)感染是宮頸癌的主要危險(xiǎn)因素，90%以上的宮頸癌伴有HR-HPV感染[1]。

microRNA(miRNAs)是一類長度為19～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平(RNA切割或翻譯抑制)負(fù)性調(diào)控靶基因的表達(dá)[2]。越來越多的研究顯示miRNAs在腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等過程中扮演著重要角色，并與其預(yù)后密切相關(guān)。人類血清或血漿中存在一些穩(wěn)定性良好的循環(huán)miRNAs，并且正常人和不同類型腫瘤患者體內(nèi)循環(huán)miRNAs的表達(dá)譜存在顯著差異[3-4]。此外，HPV感染陽性婦女的宮頸脫落細(xì)胞中miRNAs檢測對(duì)腫瘤早期診斷、分期和預(yù)后評(píng)估等方面也可能具有重要的作用[5]。因此，患者血清中及宮頸脫落細(xì)胞中異常表達(dá)的miRNAs可作為宮頸癌無創(chuàng)診斷和預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物，從而早期診斷宮頸癌，減少腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，為宮頸癌的診療提供突破點(diǎn)。

miR-18a可能作為癌基因在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要的調(diào)控機(jī)制，其表達(dá)水平在乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、肝癌、鼻咽癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等腫瘤中顯著增高[6-7]，尤其在患者血清中可以檢測到高水平的miR-18a，提示該分子有希望作為一種新型腫瘤標(biāo)志物用于腫瘤的無創(chuàng)性早期診斷，但其與宮頸癌的相關(guān)關(guān)系，目前未見文獻(xiàn)報(bào)道。

我們在前期研究中通過臨床組織標(biāo)本檢測發(fā)現(xiàn)miR-18a表達(dá)水平在宮頸癌組織中明顯高于癌旁正常組織，基于此基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)通過檢測宮頸脫落細(xì)胞中miR-18a表達(dá)與HPV感染之間的關(guān)系，以及HR-HPV感染的宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)及宮頸癌病變不同階段miR-18a表達(dá)，初步探討miR-18a表達(dá)在HPV感染及宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的意義。

1資料與方法

1.1標(biāo)本來源

收集2015年6月至2017年6月深圳市南山區(qū)婦幼保健院及廣州南方醫(yī)院門診及住院患者宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本，將細(xì)胞刷放入Preserv Cyt細(xì)胞保存液中和用于HPV DNA檢測的保存液中保存，置于4℃冰箱。通過HPV分型檢測將宮頸脫落細(xì)胞分為HPV未感染組(NE-HPV)、低危型HPV感染組(LR-HPV)、高危型HPV感染組(HR-HPV)。

選取HR-HPV檢驗(yàn)陽性標(biāo)本，經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為宮頸癌(30例)和CIN(30例)，對(duì)照組選取年齡、體重配對(duì)的30例經(jīng)液基細(xì)胞學(xué)檢查證實(shí)為宮頸上皮細(xì)胞正常無化生的女性，留取宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本凍存。所有受試者均對(duì)本研究知情同意，本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HPV DNA基因型檢測

取宮頸脫落細(xì)胞樣本保存液500μL，14 000r/min離心1min后棄上清，嚴(yán)格按照試劑盒(深圳亞能公司)操作說明進(jìn)行提取。采用核酸分子快速雜交儀及配套試劑盒，應(yīng)用標(biāo)記有23種HPV基因型別寡核苷酸探針的低密度基因芯片雜交膜(18種高危型別：16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83；5種低危型別：6、11、42、43、44)，按照試劑盒說明進(jìn)行雜交，酶標(biāo)顯色。結(jié)果判斷：陽性結(jié)果可出現(xiàn)清晰的藍(lán)紫色斑點(diǎn)，根據(jù)不同型別HPV探針在膜上的具體位置，即可判斷感染HPV類型。

1.2.2總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

取宮頸脫落細(xì)胞樣本保存液500μL，采用miRCURYTM RNA提取試劑盒(日本Takara公司)提取總RNA，Nano-drop 2000分光光度計(jì)(美國Thermo公司)檢測總RNA的純度與濃度。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用Mir-XTMmiRNA First Strand Kit試劑盒(日本Takara公司)將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，具體操作參照試劑盒使用說明。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測miR-18a表達(dá)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction， rt-qPCR)檢測宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本中miR-18a表達(dá)水平。qPCR反應(yīng)試劑盒SYBR Premix EX TaqTMⅡ購自日本Takara公司，具體步驟參照試劑盒說明書，以U6 snRNA為內(nèi)參照，所有反應(yīng)均在ABI 7500定量PCR分析儀(美國ABI公司)上進(jìn)行。反應(yīng)條件為：50℃激活聚合酶2min，95℃預(yù)變性1min；95℃變性5s，60℃退火/延伸1min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，結(jié)束后通過95℃ 15s，60℃ 1min，85℃ 15s，60℃ 15s制作溶解曲線。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，計(jì)算3個(gè)復(fù)孔的平均Ct值為最終Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)含量。引物由上海Invitrogen公司合成。U6 snRNA上游引物為5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。miR-18a上游引物為5′-TAAGGTGCATC￣TAGTGCA￣GATAG-3′；下游通用引物由反轉(zhuǎn)錄試劑盒Mir-XTMmiRNA First Strand Kit提供(日本Takara公司)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，ROC曲線評(píng)估組織miR-18a作為宮頸癌/CIN標(biāo)志物的診斷價(jià)值。采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1宮頸脫落細(xì)胞HPV DNA基因型檢測

如圖1所示，陽性結(jié)果可出現(xiàn)清晰的藍(lán)紫色斑點(diǎn)，病例3顯示為高危型HPV68型感染；病例6顯示為HPV11、16、42、52、59型混合感染；病例10顯示為高危型HPV51型感染。

圖1宮頸脫落細(xì)胞HPV DNA基因型檢測

Fig.1 Detection of HPV DNA genotype in cervical exfoliated cells

2.2宮頸脫落細(xì)胞中miR-18a表達(dá)情況

以ΔCT表示目的基因的表達(dá)水平，即ΔCT=目的基因CT值-內(nèi)參基因CT值。圖2顯示NE-HPV組、LR-HPV感染組、HR-HPV感染組的宮頸脫落細(xì)胞中miR-18a表達(dá)水平分別為1.29±0.15、1.72±0.47、3.48±0.71，HR-HPV感染組miR-18a表達(dá)顯著高于LR-HPV感染組和NE-HPV組(t值分別為11.144、18.482，均P<0.05)，而LR-HPV感染組和NE-HPV組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2不同HPV感染組中宮頸脫落細(xì)胞miR-18a的表達(dá)

Fig.2 Expression of miR-18a in cervical exfoliated cells of different HPV infection groups

2.3宮頸癌、CIN與對(duì)照組宮頸脫落細(xì)胞中miR-18a的表達(dá)情況

圖3顯示宮頸脫落細(xì)胞中，宮頸癌組、CIN組中miR-18a表達(dá)水平分別為4.01±0.57、3.22±0.65，較對(duì)照組的1.27±0.16呈顯著增高(t值分別為25.02、15.36，均P<0.05)，但宮頸癌組與CIN組兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

注：NE為對(duì)照組。

圖3宮頸癌組、CIN組與對(duì)照組宮頸脫落細(xì)胞中miR-18a的表達(dá)

Fig.3 Expression of miR-18a in cervical epithelial cells of cervical cancer group, CIN group and control group

2.4宮頸癌及CIN宮頸脫落細(xì)胞中miR-18a的ROC曲線分析

宮頸脫落細(xì)胞中miR-18a用于CIN的AUC為0.699，95%置信區(qū)間(CI)為0.606～0.791，最優(yōu)截?cái)嘀等?.317，診斷靈敏度為83.3%，特異度為73.6%，P<0.001；用于診斷宮頸癌的AUC為0.801，95%CI為0.724～0.879，最優(yōu)截?cái)嘀等?.483，診斷靈敏度為86.7%，特異度為82.3%，P<0.001，提示宮頸脫落細(xì)胞中miR-18a對(duì)CIN和宮頸癌具有良好的診斷價(jià)值，見圖4。

圖4宮頸脫落細(xì)胞中miR-18a表達(dá)對(duì)CIN(A)和宮頸癌(B)診斷價(jià)值的ROC曲線分析

Fig.4 ROC curve analysis of miR-18a expression in cervical exfoliated cells diagnosis of CIN (A) and cervical cancer (B)

3討論

3.1 miRNA可作為高危型HPV感染及宮頸癌發(fā)生發(fā)展的分子標(biāo)志物

宮頸癌是目前唯一被世界衛(wèi)生組織確定為可以通過篩查降低浸潤癌發(fā)生率的惡性腫瘤。高危型HPV檢測和宮頸細(xì)胞學(xué)檢查是目前最主要的兩種宮頸癌篩查方法。HPV檢測具有敏感性高、陰性預(yù)測值高、結(jié)果客觀可靠等優(yōu)點(diǎn)，但其最大局限性是陽性預(yù)測值低，在HPV檢測結(jié)果為陽性的大量人群中，實(shí)際發(fā)生或?qū)l(fā)生CIN或?qū)m頸癌的患者很少[8]。HPV檢測的目的不是篩查HPV感染，而是篩查出高度病變風(fēng)險(xiǎn)的人群[9]，因此，發(fā)現(xiàn)與高危型HPV感染及HPV誘導(dǎo)的宮頸病變發(fā)展(尤其是宮頸癌)密切有關(guān)的分子標(biāo)記物，對(duì)于宮頸癌的早期診斷和預(yù)警極為重要。

miRNAs可穩(wěn)定存在于各種體液中，包括血液、尿液、唾液、分泌物、眼淚、乳汁、支氣管灌洗液、精液、羊水、胸水、腹水、腦脊液等[10]。因此，越來越多的研究致力于將miRNAs作為生物標(biāo)記物用于疾病的早期臨床診斷。相對(duì)于血清標(biāo)本，宮頸黏液脫落細(xì)胞標(biāo)本來源于宮頸，因此其對(duì)宮頸癌更具有特異性。同時(shí)，它具備無創(chuàng)、易于取樣、易于檢測等優(yōu)點(diǎn)，因此宮頸黏液脫落細(xì)胞標(biāo)本中的miRNA可成為早期宮頸癌篩查良好的生物標(biāo)志物。

3.2 miR-18a通過調(diào)控多種靶基因參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展

miR-18a來源于miR-17-92基因簇，位于人染色體13q31.3，通過調(diào)控多種靶基因參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展[11]。有關(guān)miR-18a在腫瘤中的作用，有研究認(rèn)為其可能作為抑癌基因發(fā)揮作用，通過調(diào)控其下游靶基因K-Ras對(duì)腫瘤細(xì)胞體外增殖發(fā)揮抑制作用，誘導(dǎo)G1期阻滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[12-13]。而相反研究結(jié)果表明在乳腺癌、結(jié)直腸癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等多種腫瘤中，miR-18a的表達(dá)上調(diào)。上調(diào)的miR-18a通過PTEN-PI3K-AKT-mTOR活化cylinD1促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖[14]。高表達(dá)的miR-18a與鼻咽癌的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)[15]。

3.3 miR-18a表達(dá)增高可能參與HPV介導(dǎo)的子宮頸癌的發(fā)病機(jī)制

我們也在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)miR-18a表達(dá)在大多數(shù)宮頸癌組織中明顯高于正常組織，本研究結(jié)果顯示，宮頸脫落細(xì)胞中miR-18a表達(dá)水平在HR-HPV感染組顯著高于LR-HPV感染組及NE-HPV組，而LR-HPV感染組與NE-HPV組間未顯示出顯著差異，提示miR-18a表達(dá)水平的增高參與了高危型HPV的感染及對(duì)子宮頸癌變的致病過程，具體機(jī)制還有待研究。在高危HPV感染的宮頸脫落細(xì)胞中，CIN(包括CIN1～3級(jí))及子宮頸癌組中miR-18a水平顯著高于對(duì)照組，提示miR-18a表達(dá)水平增高可能參與了HPV介導(dǎo)的子宮頸癌的發(fā)病機(jī)制，并可能直接參與從病毒感染的初始階段向癌前病變及子宮頸癌階段的惡性轉(zhuǎn)化過程。miR-18a表達(dá)水平在宮頸癌組、CIN組中并無顯著性差異，提示一旦發(fā)展為癌前病變后，miR-18a表達(dá)水平與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展并沒有顯著關(guān)聯(lián)，但miR-18a和宮頸癌病理學(xué)不同發(fā)展階段的相關(guān)性有待大樣本的進(jìn)一步研究證實(shí)。ROC曲線結(jié)果分析miR-18a用于診斷CIN的AUC為0.699，診斷靈敏度為83.3%，特異度為73.6%；用于診斷宮頸癌的AUC為0.801，診斷靈敏度為86.7%，特異度為82.3%，提示宮頸脫落細(xì)胞中miR-18a對(duì)CIN及宮頸癌具有良好的診斷價(jià)值，且宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本易于獲得，具備早期無創(chuàng)、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，有望成為早期宮頸癌篩查良好的生物標(biāo)志物。