姜雪梅，錢(qián)越，戴紅良

（錦州醫(yī)科大學(xué) 1. 附屬第一醫(yī)院消化科； 2. 附屬第一醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)與臨床免疫研究中心； 3. 護(hù)理學(xué)院社區(qū)護(hù)理學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001）

肺癌在我國(guó)發(fā)病率極高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年約有52萬(wàn)肺癌新發(fā)病例出現(xiàn)，死亡率為45萬(wàn)/年。其中，超過(guò)80%的晚期肺癌屬于非小細(xì)胞肺癌［1］。盡管過(guò)去的20年間，人們對(duì)于肺癌有了更加充分的理解，但肺癌患者的5年生存率仍然很低［2］。染料木黃酮是大豆中重要的植物化學(xué)物，具有較強(qiáng)的酪氨酸激酶抑制活性［3-4］。近年來(lái)，染料木黃酮的抗癌作用備受關(guān)注。研究顯示，染料木黃酮可抑制結(jié)腸直腸癌［5］、肝癌［6］、乳腺癌［7］及口腔癌［3］等多種癌細(xì)胞的增殖。也有研究［8-9］顯示，染料木黃酮對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用。本研究擬觀察染料木黃酮對(duì)非小細(xì)胞肺癌PC14細(xì)胞增殖的影響，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

染料木黃酮 （純度99.1%，中國(guó)藥品生物制品檢定所），DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清 （美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），二甲基亞砜、噻唑藍(lán)、結(jié)晶紫、PD98059、SB203580、SP600125 （美國(guó)Sigma公司），p-ERK抗體 （沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司），JNK，p-JNK和ERK抗體 （美國(guó)Abcam公司），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗 （美國(guó)Santa Cruz公司），二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），倒置顯微鏡 （德國(guó)LEICA公司），潔凈工作臺(tái) （青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司），酶標(biāo)儀 （美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀 （美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：人非小細(xì)胞肺癌PC14細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃，5% CO2飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)。0.25% EDTA胰酶消化傳代，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理。

1.2.2 細(xì)胞增殖檢測(cè)：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC14細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)過(guò)夜，每孔分別加入0、2.5、5、10、20 mg/L染料木黃酮繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。藥物作用結(jié)束后，每孔加入5 g/L的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，隨后以150 μL DMSO充分溶解甲臜后，在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔吸光度值。

1.2.3 細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)：將PC14細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔600個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)夜后，每孔加入0、2.5、5、10、20 mg/L染料木黃酮繼續(xù)培養(yǎng)10 d，隨后棄去培養(yǎng)液并用PBS沖洗3遍，4%多聚甲醛固定后結(jié)晶紫染色并拍照。

1.2.4 蛋白提取和免疫印跡：收集細(xì)胞，加入含0.1% PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白。蛋白經(jīng)10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜。以新鮮配置1% BSA室溫下封閉1 h，TBST洗膜后，加入用TBST稀釋的一抗4 ℃孵育過(guò)夜。用TBS-T充分洗去非特異結(jié)合的抗體后，室溫下用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育2 h。TBS-T充分洗滌后，ECL顯色后經(jīng)凝膠成像儀成像分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 染料木黃酮對(duì)PC14細(xì)胞增殖的影響

不同濃度染料木黃酮處理PC14細(xì)胞24、48和72 h后，細(xì)胞增殖隨著藥物濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì)；集落形成實(shí)驗(yàn)也顯示，染料木黃酮可劑量依賴(lài)性地抑制PC14細(xì)胞集落的形成，見(jiàn)表1，圖1。

2.2 MAPK抑制劑對(duì)PC14細(xì)胞增殖的影響

表1 染料木黃酮對(duì)PC14細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用 （±s，n = 6）Tab.1 Inhibitory effects of genistein on PC14 cell growth （±s，n = 6）

表1 染料木黃酮對(duì)PC14細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用 （±s，n = 6）Tab.1 Inhibitory effects of genistein on PC14 cell growth （±s，n = 6）

1） P < 0.05 vs control group at the same time point.

Optical density 24 h 48 h 72 h Control 0.21±0.02 0.36±0.03 0.47±0.02 Genistein 2.5 mg/L 0.22±0.03 0.36±0.02 0.46±0.05 Genistein 5 mg/L 0.22±0.01 0.37±0.02 0.33±0.051）Genistein 10 mg/L 0.20±0.02 0.35±0.03 0.21±0.041）Genistein 20 mg/L 0.22±0.03 0.26±0.031） 0.11±0.021）Group

ERK特異性阻斷劑PD98059、p38MAPK特異性阻斷劑SB203580及JNK特異性阻斷劑SP600125可使對(duì)照組MTT吸光度值由0.49分別下降至0.36、0.28及0.22。表明這3個(gè)MAPK分子在PC14細(xì)胞中均起到促進(jìn)增殖的作用。

2.3 染料木黃酮對(duì)PC14細(xì)胞MAPK信號(hào)通路的影響

PC14細(xì)胞經(jīng)不同濃度染料木黃酮處理后，p-p38MAPK蛋白的表達(dá)不受藥物影響，而p-ERK及p-JNK的水平均隨著藥物濃度的增加而逐漸減弱，見(jiàn)圖2。

3 討論

圖1 染料木黃酮對(duì)PC14細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effects of genistein on PC14 cell proliferation

圖2 染料木黃酮對(duì)PC14細(xì)胞ERK及JNK通路的影響Fig.2 Effect of genistein on the ERK and JNK pathways in PC14 cells

近年來(lái)，天然物質(zhì)高效低毒的特性受到藥物研究人員的廣泛關(guān)注。染料木黃酮是存在于大豆等植物中的天然異黃酮類(lèi)非營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。研究［3-4］證實(shí)，該物質(zhì)具有抑制平滑肌源性泡沫細(xì)胞的形成、抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫及抗腫瘤等多種生物活性。研究［3］顯示，染料木黃酮對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)均顯示出強(qiáng)大的抑制作用，而其對(duì)非小細(xì)胞肺癌作用和機(jī)制的研究尚處于初步階段。本研究證實(shí)，染料木黃酮能顯著抑制非小細(xì)胞肺癌PC14細(xì)胞的增殖，這與凌藝輝等［10］（H1299細(xì)胞） 及崔俊英等［11］（H1975） 報(bào)道的結(jié)果類(lèi)似。同時(shí)，相較口腔癌TCA8113細(xì)胞，PC14細(xì)胞對(duì)染料木黃酮似乎更為敏感，2.5 mg/L的染料木黃酮即可顯著降低肺癌細(xì)胞增殖［3］。

MAPKs屬絲/蘇氨酸蛋白激酶家族，主要包括ERK、JNK和p38MAPK 3個(gè)家族成員，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、遷移、侵襲、炎癥、死亡等多種生物學(xué)過(guò)程中都起著極為重要的作用［12］。但隨著細(xì)胞類(lèi)型、刺激條件、刺激時(shí)程等的不同，MAPKs家族既可以誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖，又可能導(dǎo)致其死亡［12-13］。本研究發(fā)現(xiàn)，MAPKs特異性抑制劑可顯著抑制PC14細(xì)胞的增殖，表明MAPKs分子的活化對(duì)于PC14細(xì)胞的增殖是不可或缺的。與此同時(shí)，本研究還證實(shí)染料木黃酮可顯著抑制ERK及JNK的活化?；谏鲜鼋Y(jié)果，染料木黃酮對(duì)PC14細(xì)胞的增殖抑制活性與其對(duì)ERK及JNK的抑制有關(guān)。

肺癌在世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率都很高，臨床上的治療手段目前主要有手術(shù)、放療和化療等，但目前的化療藥物一般不良反應(yīng)都較大，且其療效有限［14-15］。因此，開(kāi)發(fā)新型高效低毒的抗肺癌藥物仍然是擺在藥物工作者面前的一項(xiàng)重任。本研究證實(shí)，染料木黃酮可通過(guò)調(diào)控ERK和JNK的活化抑制肺癌細(xì)胞的增殖，染料木黃酮屬于天然活性化合物，與傳統(tǒng)化療藥物相比，其療效確切、來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉、不良反應(yīng)小，有望成為臨床上治療肺癌的新選擇。