楊偉強(qiáng) 萬伯順# 常 慶

上海市嘉定區(qū)中心醫(yī)院外科1(201800) 中心實(shí)驗(yàn)室2

背景：胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，抑制胃癌細(xì)胞增殖是抗癌藥物研發(fā)的關(guān)鍵。目的：研究獐牙菜苦苷在體內(nèi)外對MGC803細(xì)胞增殖的影響。方法：MGC803細(xì)胞予以不同濃度獐牙菜苦苷(0、30、60、90 μg/mL)培養(yǎng)48 h，以MTT法檢測細(xì)胞活性，Annexin V-FITC/PI法檢測細(xì)胞凋亡率，ELISA法檢測Bax、Bcl-2含量。建立BALB/c裸鼠MGC803移植瘤模型，尾靜脈注射不同濃度獐牙菜苦苷(0、40、60、80 mg/kg)，腫瘤體積長至1 000 mm3時(shí)處死裸鼠，記錄裸鼠開始和最終的體質(zhì)量，以免疫組化法檢測Ki-67蛋白表達(dá)。結(jié)果：與對照組相比，不同濃度獐牙菜苦苷可有效抑制MGC803細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，Bax含量明顯升高，Bcl-2含量明顯降低(P<0.05)。在MGC803細(xì)胞裸鼠移植瘤模型中，不同濃度獐牙菜苦苷組的腫瘤體積較對照組明顯縮小(P<0.05)，Ki-67蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.05)。結(jié)論：獐牙菜苦苷是一種安全有效的抗胃癌的植物單體。

消化系統(tǒng)腫瘤是臨床上最常見的惡性腫瘤，其中胃癌的發(fā)病率較高，發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已處于較晚期，患者的總體預(yù)后不良[1]。目前胃癌的治療以手術(shù)切除并配合術(shù)后放化療為主，但目前手術(shù)切除并不能保證完全清掃，且主流放化療藥物的療效欠佳，毒副作用相對較大。異常的凋亡減少是胃癌發(fā)生、發(fā)展的重要因素之一，尋找新的化合物誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡仍是目前臨床工作的探索熱點(diǎn)[2]。獐牙菜苦苷屬于裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類化合物，廣泛存在多種植物中[3-5]。既往藥理學(xué)研究證實(shí)，獐牙菜苦苷(結(jié)構(gòu)式：C16H22O10)具有抗肝纖維化、解痙、消炎、鎮(zhèn)痛等多種藥理活性作用[6-9]。本研究通過給予胃癌MGC803細(xì)胞及其移植瘤小鼠模型不同濃度的獐牙菜苦苷，旨在探討獐牙菜苦苷對MGC803細(xì)胞的體內(nèi)外抑制作用。

材料與方法

一、細(xì)胞株、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑

胃癌細(xì)胞株MGC803由上海中科院細(xì)胞庫提供。RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清購自美國Gibco公司。MTT、二甲基亞砜(DMSO)由美國Sigma-Aldrich公司提供。1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液購于碧云天生物技術(shù)有限公司。獐牙菜苦苷標(biāo)準(zhǔn)品純度>98%, 購自于上海諾辰生物技術(shù)有限公司。Bcl-2、Bax酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒購自上海悉墨生物科技有限公司。Ki-67一抗抗體購自美國Abcam公司。

24只雄性BALB/c裸鼠(SPF級)購于上海市腫瘤研究所，約8周齡，體質(zhì)量(20±1) g，飼養(yǎng)于上海腫瘤研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，光暗周期12 h∶12 h，自由飲食、飲水。

二、方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)：胃癌MGC803細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。獐牙菜苦苷標(biāo)準(zhǔn)品以DMSO溶解備用，DMSO終濃度不超過0.1%。

2. MTT法檢測細(xì)胞活性：取對數(shù)生長期的MGC803細(xì)胞，加入適量胰蛋白酶消化，吹打制成單個(gè)細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×103/mL，以每孔200 μL接種于96孔培養(yǎng)板上。各孔分別加入不同濃度的獐牙菜苦苷(0、20、40、80、100 μg/mL)，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)12、24、48 h后，加入MTT 20 μL/孔，培養(yǎng)4 h。吸除孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩混勻后，上酶標(biāo)儀測定570 nm波長處的吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞生存率。細(xì)胞生存率(%)=用藥組A值/對照組A值×100%，采用中效直線回歸曲線計(jì)算細(xì)胞半數(shù)抑制濃度(IC50)。

3. Annexin V-FITC/PI法檢測細(xì)胞凋亡：取胃癌MGC803細(xì)胞，制成1×106/mL的細(xì)胞懸液，鋪設(shè)于24孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞長至60%～70%密度時(shí)，加入不同濃度的獐牙菜苦苷(0、30、60、90 μg/mL)。培養(yǎng)48 h后，胰酶消化細(xì)胞，以含血清的完全培養(yǎng)基終止消化，吹打成細(xì)胞懸液。具體步驟按照Annexin V-FITC/PI檢測試劑盒說明書操作，采用BD-FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

4. ELISA法檢測Bax、Bcl-2含量：取不同濃度獐牙菜苦苷(0、30、60、90 μg/mL)處理48 h后的MGC803細(xì)胞凍融裂解，4 ℃ 4 378×g離心10 min，分離上清液并檢測蛋白濃度。參照試劑盒說明書，經(jīng)包被、加樣、加抗體、底物液顯色后，酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的各孔A值，根據(jù)A值和標(biāo)準(zhǔn)品濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算測試樣本的Bax和Bcl-2含量并計(jì)算Bax/Bcl-2比值。

5. MGC803細(xì)胞裸鼠移植瘤模型的建立和分組：取對數(shù)生長期MGC803細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，將200 μL細(xì)胞懸液經(jīng)右側(cè)腹腔皮下注射于BALB/c裸鼠，建立裸鼠移植瘤模型。每三天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的最長徑(a)和最短徑(b)，計(jì)算瘤體積，瘤體積(mm3)=1/2×a×b2。待瘤體積長至 100 mm3時(shí)，隨機(jī)將裸鼠分為對照組、獐牙菜苦苷組(40、60、80 mg/kg)，每組各6只。將獐牙菜苦苷溶解于5% DMSO/0.9% NaCl溶液中，每日尾靜脈注射一次，對照組給予同等劑量5% DMSO/0.9% NaCl溶液。記錄裸鼠開始和最終的體質(zhì)量，平均瘤體積>1 000 mm3時(shí)，麻醉下頸椎脫離法處死裸鼠，取出移植瘤并稱重。計(jì)算抑瘤率，抑瘤率(%)=(1-給藥組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100%。

6. 免疫組化法檢測Ki-67表達(dá)：處死裸鼠后，取移植瘤組織，4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片。加入Ki-67抗體(工作濃度1∶200)4 ℃冰箱過夜；加入二抗37 ℃下孵育2 h，DAB顯色，光鏡下觀察。

結(jié)果判定：細(xì)胞核呈棕黃色顆粒為細(xì)胞陽性，計(jì)算Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)占所有細(xì)胞的比例。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、體外實(shí)驗(yàn)

1. 細(xì)胞生存率：MTT實(shí)驗(yàn)表明，獐牙菜苦苷的IC50為(56.51±6.20) μg/mL。不同濃度、不同培養(yǎng)時(shí)間獐牙菜苦苷對MGC803細(xì)胞增殖均存在一定程度的抑制作用(表1)。

2. 細(xì)胞凋亡率：Annexin V-FITC/PI法檢測結(jié)果顯示，與0 μg/mL 獐牙菜苦苷組相比，30、60、90 μg/mL 獐牙菜苦苷組MGC803細(xì)胞凋亡率均明顯上升(19.03%±1.30%、41.78%±5.96%、57.34%±8.43%對6.82%±1.04%,P<0.05)(圖1)，且呈劑量依賴性(P<0.05)。

3. Bax、Bcl-2含量：ELISA法檢測結(jié)果顯示，與0 μg/mL獐牙菜苦苷組相比，30、60、90 μg/mL獐牙菜苦苷組促凋亡因子Bax含量明顯升高(P<0.01)，而抑制細(xì)胞凋亡因子Bcl-2含量明顯降低(P<0.01)，Bax/Bcl-2比值升高，且呈劑量依賴性(P<0.05)(表2)。說明獐牙菜苦苷可誘導(dǎo)胃癌MGC803細(xì)胞凋亡。

二、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

1. 抑瘤率：與對照組相比，不同濃度獐牙菜苦苷組(40、60、80 mg/kg)裸鼠的瘤重均明顯降低(P<0.001)，同時(shí)抑瘤率明顯升高(表3)。

表1 不同濃度獐牙菜苦苷組的細(xì)胞生存率比較

與同時(shí)間點(diǎn)0 μg/mL獐牙菜苦苷組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

組別Bax(pg/mL)Bcl-2(pg/mL)Bax/Bcl-2比值0 μg/mL302.48±30.59153.36±21.481.97±0.4630 μg/mL356.17±48.16117.27±19.423.04±0.6060 μg/mL436.81±56.7493.65±13.694.66±0.8990 μg/mL513.69±73.2076.28±14.346.73±1.27

與0 μg/mL獐牙菜苦苷組比較，*P<0.05，**P<0.001

表3 各組MGC803移植瘤重量

*與對照組比較，P<0.001

2. Ki-67表達(dá)：免疫組化結(jié)果證實(shí)，與對照組相比，40、60、80 mg/kg獐牙菜苦苷組Ki-67陽性表達(dá)率明顯降低(55.14%±5.77%、28.18%±5.73%、10.25%±2.06%對68.27%±8.69%，P<0.05)，且呈劑量依賴性(P<0.05)(圖2)。

討 論

獐牙菜苦苷是一種具有多種藥理活性的植物單體，目前研究多集中于代謝紊亂相關(guān)疾病的治療和預(yù)防，但尚缺乏其藥效分子機(jī)制、藥代動(dòng)力學(xué)以及毒性方面的研究。在腫瘤研究領(lǐng)域，有學(xué)者初步證實(shí)了獐牙菜苦苷的體外抗腫瘤活性。趙李劍等[10]的研究顯示，50 μg/mL獐牙菜苦苷對肝癌細(xì)胞具有抑制、促凋亡作用。李潤琴等[11]亦證實(shí)，川東獐牙菜提取物可抑制HepG2人肝癌細(xì)胞生長并促進(jìn)其凋亡，獐牙菜苦苷和芒果苷是其主要活性物質(zhì)。但目前獐牙菜苦苷抑制腫瘤細(xì)胞的機(jī)制尚未完全清楚。

細(xì)胞凋亡是主要的抗腫瘤途徑。藥物阻滯腫瘤細(xì)胞生長往往是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典的Annexin V-FITC/PI法檢測細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示不同濃度的獐牙菜苦苷均可誘導(dǎo)胃癌MGC803細(xì)胞的早期和晚期凋亡，且呈劑量依賴性，證實(shí)獐牙菜苦苷可誘導(dǎo)MGC803細(xì)胞凋亡。Bax/Bcl-2比值在細(xì)胞生理過程，特別是線粒體生理過程中起有重要作用[12]。Bax/Bcl-2比值升高可導(dǎo)致線粒體膜電位失衡，激活caspase-3等凋亡途徑，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長[13]，但詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)，獐牙菜苦苷可有效升高Bax/Bcl-2比值，從而誘導(dǎo)胃癌MGC803細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。

圖1 各組細(xì)胞凋亡率的流式細(xì)胞圖(Annexin V-FITC/PI法)

圖2 各組Ki-67的表達(dá)情況(免疫組化染色，×200)

進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，各組MGC803細(xì)胞移植瘤的裸鼠體質(zhì)量無明顯差異，說明獐牙菜苦苷在裸鼠體內(nèi)是一種安全的藥物。同時(shí)，不同濃度的獐牙菜苦苷給藥后，MGC803移植瘤體積均明顯縮小。說明獐牙菜苦苷可有效抑制MGC803胃癌細(xì)胞移植瘤的生長。Ki-67蛋白是一種與細(xì)胞增殖相關(guān)的核抗原，可反映腫瘤細(xì)胞的增殖活性[14]。本實(shí)驗(yàn)中，隨著獐牙菜苦苷給藥濃度的增加，Ki-67蛋白水平逐漸下降并呈劑量依賴性，證實(shí)獐牙菜苦苷可抑制MGC803移植瘤的增殖。

綜上所述，本研究通過體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)獐牙菜苦苷具有明顯的抗腫瘤活性，其作用機(jī)制可能是通過升高Bax/Bcl-2比值，從而引起腫瘤細(xì)胞凋亡并抑制其增殖。獐牙菜苦苷作為一種自然界廣泛存在的植物單體，在多種植物中均可穩(wěn)定獲得，為含獐牙菜苦苷的植物的綜合利用和藥理開發(fā)奠定基礎(chǔ)，如后期修飾結(jié)構(gòu)、改善療效，有望成為一種新型的抗腫瘤藥物。但其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。