夏 莉 劉麗娟 王 香 孫立成 付勁蓉 韓 曉 錢莉玲 周玉峰,2

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是兒童呼吸道最常見的慢性疾病之一，主要表現(xiàn)為氣道慢性炎癥與氣道高反應(yīng)性[1]。哮喘是由遺傳、環(huán)境和表觀遺傳學(xué)因素共同作用而導(dǎo)致的一種炎癥性疾病[2, 3]。流行病學(xué)研究顯示，近年來哮喘的發(fā)病率呈快速上升的趨勢[4]，DNA序列不可能在短期內(nèi)發(fā)生劇烈變異，因而表觀遺傳學(xué)因素的改變可能在其中發(fā)揮更大作用。表觀遺傳學(xué)調(diào)控包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA等[5]。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類本身不編碼蛋白、轉(zhuǎn)錄本長度>200個核苷酸的RNA分子，可在多層面上(表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等)調(diào)控基因的表達，已經(jīng)成為免疫學(xué)關(guān)注的熱點[6]。巨噬細(xì)胞是呼吸道最主要的炎癥細(xì)胞，在哮喘的發(fā)病中起著重要作用[7]。巨噬細(xì)胞根據(jù)激活途徑的不同，可分為經(jīng)典激活M1型和替代激活M2型，巨噬細(xì)胞的活化狀態(tài)可直接影響炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸[8]，目前有關(guān)LncRNA對巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控及在哮喘發(fā)病中的作用還少有報道。有報道LncRNA LINC01503能促進細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)的活化，因此推測LncRNA LINC01503對巨噬細(xì)胞極化具有調(diào)控作用，本研究期望為非編碼RNA調(diào)控的巨噬細(xì)胞極化在哮喘疾病中的作用提供實驗證據(jù)。

1 方法

1.1 研究設(shè)計 病例對照研究。哮喘組為門診診斷哮喘的患兒，健康對照組為健康體檢兒童，檢測兩組外周血單個核細(xì)胞(PBMC)中LncRNA LINC01503的表達情況。通過siRNA敲低THP1細(xì)胞系中LncRNA LINC01503的表達，探索LncRNA LINC01503對巨噬細(xì)胞M1和M2型極化的調(diào)控作用。

1.2 倫理 本研究實驗方案得到了復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院(我院)倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.3 哮喘組納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 納入同時滿足以下各項的連續(xù)患兒：①2017年8月26日至2018年1月11日我院呼吸科門診喘息反復(fù)發(fā)作且未正規(guī)治療的患兒，②由同1名主治醫(yī)生接診并參照2016版《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》[9]診斷為哮喘，③獲得患兒家長口頭知情同意采血用于本研究檢測。排除合并其他呼吸道疾病(如肺炎)、心血管系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病的患兒。

1.4 健康對照組納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 納入在我院健康體檢門診行體檢的兒童，根據(jù)哮喘組入組患兒的性別和年齡按1∶2進行匹配。獲得對照組兒童家長的口頭知情同意，采血用于本研究檢測。排除有過敏史及近期呼吸道感染者。

1.5 PBMC分離 采用Ficoll-Hypaque(GE Healthcare)梯度離心法。將血液用PBS等體積稀釋，緩慢加入等體積的Ficoll-Hypaque中，400 g 緩升緩降離心30 min，吸取第二層單個核細(xì)胞懸浮液，加入新的離心管，離心，PBS洗2次，所獲得細(xì)胞即為PBMC。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng) THP1細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。細(xì)胞培養(yǎng)條件：在含有10%胎牛血清(Gibico)、100 U·mL-1青霉素、50 μg · mL-1鏈霉素的1 640(Gibico)培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2濃度的條件下培養(yǎng)。巨噬細(xì)胞分化：500 ng·mL-1佛波酯(PMA，Sigma)刺激THP1細(xì)胞48 h，換液，棄掉懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞即為分化的巨噬細(xì)胞。

1.7 siRNA 轉(zhuǎn)染 siRNA序列見表1，由上海吉瑪生物公司設(shè)計。siRNA轉(zhuǎn)染濃度為200 nmol·L-1，使用LipoRNAiMax(invotrogen)進行轉(zhuǎn)染。 細(xì)胞于轉(zhuǎn)染后第2 d進行換液，轉(zhuǎn)染48 h后加LPS或IL-4刺激巨噬細(xì)胞。

1.8 RT-qPCR 在炎癥狀態(tài)下，外周血單核細(xì)胞會進入肺部轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞[10]。巨噬細(xì)胞是呼吸道數(shù)量最多的免疫細(xì)胞，在不同環(huán)境因素的刺激下會向不同的方向活化，伴隨一系列基因的表達發(fā)生動態(tài)變化，從而對疾病發(fā)揮不同的調(diào)控作用[8]。為探究LINC01503在巨噬細(xì)胞不同活化過程中其表達是否發(fā)生改變，分別采用LPS 200 ng·mL-1和IL-4 20 ng·mL-1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1和M2方向活化，RT-qPCR檢測LINC01503的表達情況。采用Trizol(Ambion)提取總RNA，用Takara RR037A 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將Total RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用上海翊圣生物科技公司HieffTMqPCR SYBR?Green Master Mix(No Rox)進行qPCR熒光定量檢測。Primer premier 5 用于引物設(shè)計，序列見表1，引物由上海生工公司合成。采用GAPDH作為內(nèi)參，數(shù)據(jù)分析采用2-△△CT法。

表1 siRNA序列及RT-qPCR引物序列

1.9 Western blot 分離膠和濃縮膠配膠試劑購于上海碧云天生物公司及上海生工公司。Western blot 所使用抗體: P65、p-P65(ser536)、P38、p-P38: (Thr180/Tyr182)、JNK、p-JNK(Thr183/Tyr185)、ERK1/2、p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)、STAT6和p- STAT6 (Tyr641)均購于美國Cell Signaling Technology 公司。電泳、轉(zhuǎn)膜、顯影等相關(guān)儀器購于美國Bio-rad 公司。Western blot具體實驗步驟參照抗體官網(wǎng)使用說明書。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 符合本文哮喘組和健康對照組納入和排除標(biāo)準(zhǔn)的樣本分別為28例和46例，28例哮喘患兒均為輕癥哮喘。哮喘組男∶女為19∶9，中位年齡5.0(2～11)歲；外周血平均嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)每微升(425.8±248.7)個(正常值 60～300)，總IgE陽性率50.0%，氣道阻力升高占74%。健康對照組男∶女為29∶17，中位年齡7.5(4～13)歲，均未行外周血嗜酸性粒細(xì)胞、IgE及氣道阻力檢測。

2.2 哮喘組和健康對照組PBMC中LINC01503的表達 圖1A 顯示，與健康對照組相比，LINC01503在哮喘組中的表達顯著增高[(1.63±0.10)vs(1.01±0.04)，t=6.163，P<0.000 1]。圖1B顯示， 在哮喘組中，LINC01503的表達量與嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量不相關(guān)(P=0.40)。

2.3 LINC01503 在巨噬細(xì)胞不同極化過程中的表達 LPS刺激巨噬細(xì)胞后，LINC01503表達下調(diào)(圖2A)。IL-4刺激巨噬細(xì)胞后，LINC01503表達上調(diào)(圖2B)。

2.4 LINC01503對巨噬細(xì)胞極化的影響 本文設(shè)計的siRNA能有效降低LINC01503的表達，敲低效率80%以上(圖3A)。在敲低LINC01503后，M2型巨噬細(xì)胞活化標(biāo)志基因CD206和CD209表達明顯上調(diào)(圖3B、C)，M1巨噬細(xì)胞活化的標(biāo)志基因IL-6 、TNF-α和CXCL10的表達顯著降低(圖3D、E、F)。

2.5 LINC01503對巨噬細(xì)胞極化信號通路的影響 ①敲低LINC01503，LPS刺激巨噬細(xì)胞向M1方向極化，Western blot檢測了對NF-κB及MAPK信號通路的影響，P65、P38和JNK的磷酸化水平未受明顯影響，ERK的磷酸化水平明顯降低(圖4A)。②Western blot顯示，敲低LINC01503后對IL-4信號通路中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子6(STAT6)磷酸化的影響不明顯(圖4B)。

圖1LINC01503在哮喘患者中的表達顯著升高

注 A:采用RT-qPCR法檢測LINC01503在哮喘組和健康對照組PBMC中的表達；B：LINC01503變化倍數(shù)與嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)的相關(guān)性分析。****，P<0.000 1

圖2LINC01503在巨噬細(xì)胞極化中動態(tài)表達

注 A：LPS刺激巨噬細(xì)胞向M1方向極化，B：IL-4刺激巨噬細(xì)胞向M2方向極化，采用RT-qPCR法檢測LINC01503在巨噬細(xì)胞極化中的動態(tài)表達

圖3LINC01503對巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)

注 A:siRNA敲低LINC01503的表達；IL-4刺激已經(jīng)敲低LINC01503表達的巨噬細(xì)胞24 h, RT-qPCR檢測CD206(B)和CD209(C)的表達；LPS刺激已經(jīng)敲低LINC01503表達的巨噬細(xì)胞1.5 h, RT-qPCR檢測IL-6(D)、TNF-α(E)和CXCL10(F)的表達。*P<0.05，**P<0.01，****P<0.000 1

圖4LINC01503促進ERK磷酸化

注 A：敲低LINC01503，LPS刺激15 min，Western blot檢測了對NF-κB及MAPK信號通路的改變情況；B：敲低LINC01503后IL-4刺激15 min，檢測對信號通路中STAT6磷酸化的影響

3 討論

哮喘如今被視為一組異質(zhì)性疾病，不同的哮喘表型具有不同的發(fā)病機制[11]，但炎癥是哮喘發(fā)病的核心環(huán)節(jié)[1, 12]。既往對哮喘發(fā)病機制的研究主要集中于Th1/Th2細(xì)胞失衡、肥大細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞等釋放的炎癥因子對哮喘的影響 ，而巨噬細(xì)胞在哮喘發(fā)病中的作用并未引起足夠重視[7, 13]。

巨噬細(xì)胞作為聯(lián)系固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁，在許多慢性炎癥性疾病和免疫性疾病如肥胖、動脈粥樣硬化、糖尿病、肝臟纖維化、潰瘍性結(jié)腸炎以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中均發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[14]。巨噬細(xì)胞作為呼吸道最豐富的免疫細(xì)胞，對氣道的炎癥及免疫反應(yīng)發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[13]。巨噬細(xì)胞的不同活化類型與哮喘的嚴(yán)重程度及疾病的異質(zhì)性有很大關(guān)系[15, 16]。在以Th2免疫反應(yīng)為主的哮喘患者中，呼吸道巨噬細(xì)胞在高Th2炎癥因子的刺激下向M2方向活化，活化的M2巨噬細(xì)胞可以高表達一系列細(xì)胞因子及趨化因子，繼而促進Th2免疫反應(yīng)而加重哮喘；在非Th2免疫反應(yīng)的環(huán)境中，巨噬細(xì)胞被誘導(dǎo)向M1方向活化，活化的M1巨噬細(xì)胞可高表達IL-6、TNF-α及活性氮、氧分子，促進機體的Th1、Th17免疫反應(yīng)，降低機體對激素治療的敏感性，從而導(dǎo)致難治性哮喘的發(fā)生[3, 17]。巨噬細(xì)胞活化與刺激因素之間往往形成正反饋調(diào)控，因而無論在Th2型或非Th2型過敏性哮喘中，巨噬細(xì)胞活化不平衡的結(jié)果均能加重哮喘。因此，探索能夠調(diào)控巨噬細(xì)胞活化的分子或許能為不同類型哮喘的發(fā)病及治療提供新的思路[18]。

M1型巨噬細(xì)胞主要由LPS和IFN-γ等激活，MAPK和NF-κB等信號通路在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用；M2型巨噬細(xì)胞主要由IL-4和IL-13等激活，主要涉及JAK-STAT-6信號通路[19, 20]。有研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA LINC01503可與ERK2結(jié)合，抑制雙特異性蛋白磷酸酶6(DUSP-6)對ERK2的去磷酸化作用，導(dǎo)致ERK磷酸化增加，而促進腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[21]。但LINC01503對巨噬細(xì)胞的活化及哮喘中的作用尚未見報道。因為LINC01503參與MAPK信號通路的調(diào)控，推測LINC01503可能會參與巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控。本研究顯示，與健康對照兒童相比，LINC01503 高表達于哮喘組患兒；在M2活化的巨噬細(xì)胞中，LINC01503表達增高，而在M1活化的巨噬細(xì)胞中LINC01503表達下降。敲低LINC01503能上調(diào)巨噬細(xì)胞M2標(biāo)志基因CD206和CD209表達, 下調(diào)M1標(biāo)志基因如IL-6、TNF-α和CXCL10的表達。說明LINC01503能促進巨噬細(xì)胞向M1活化，抑制其向M2活化。在蛋白水平，本研究發(fā)現(xiàn)，LINC01503能促進ERK的磷酸化，但對M1活化有關(guān)的NF-κB、p38、JNK及M2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子STAT6等無顯著影響，說明在巨噬細(xì)胞中，LINC01503主要通過促進ERK磷酸化促進M1的活化而抑制M2的活化。

兒童哮喘與成人有所不同，主要以Th2型過敏性哮喘為主。LINC01503可被Ⅱ型免疫反應(yīng)因子如IL-4誘導(dǎo)表達，高表達的LINC01503能抑制巨噬細(xì)胞M2型活化，促進M1型活化，從而維持巨噬細(xì)胞活化的平衡。因此LINC01503可通過促進巨噬細(xì)胞活化的平衡，從而在一定程度上緩解哮喘的病情，這一結(jié)果與本文哮喘組患兒主要為輕度哮喘患者事實相一致。綜上，LINC01503可通過負(fù)反饋調(diào)控巨噬細(xì)胞活化而促進巨噬細(xì)胞不同活化類型之間的平衡進而緩解疾病的進展。LINC01503有望成為判斷病情的初步指標(biāo)及治療哮喘的潛在分子靶點。