李雪雁，武曉堯，孫春麗，謝輝燦，王金龍

(蘭州理工大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730050)

菊芋(Jerusalemartichoke)塊莖中菊糖含量為其干重的55%～83%，是自然界已知含有菊糖的36 000種植物中含量最高的植物之一[1]。菊糖，又稱(chēng)菊粉，是由呋喃構(gòu)型的D-果糖經(jīng)β-(2,1)糖苷鍵脫水聚合而成的果聚糖混合物[2]。不同聚合度的果糖具有不同的生理功能，低聚合度的果糖可以促進(jìn)人體腸道雙歧桿菌的增殖，改善腸道功能，提高免疫力和抗病力[3-5]。

由于菊糖易溶于水，加熱溶解更快[6]，因此工業(yè)上提取菊糖一般都采用熱水浸提法，在提取過(guò)程中一些雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、果膠、色素等也隨之被提取出來(lái)，因而菊芋粗提液需進(jìn)行脫色、脫蛋白等去雜過(guò)程[7]。目前脫蛋白主要采用Sevage法、三氯乙酸法、HCl法、石灰乳法、樹(shù)脂純化法等[8-12]。菊芋提取液中還含有果糖、葡萄糖等還原糖，要得到高純度的菊糖，還需額外采用一些方法(如膜過(guò)濾等)將還原性糖去除[13-14]。由于現(xiàn)行菊糖的工業(yè)化生產(chǎn)工序較復(fù)雜，導(dǎo)致成本較高。基于微生物在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中消耗糖類(lèi)和蛋白質(zhì)作為其碳源和氮源，因此將篩選的不降解菊糖的微生物菌株接入菊芋粗提液中，在適宜條件下培養(yǎng)，可逐漸將粗提液中的還原糖和蛋白質(zhì)消耗，即可達(dá)到菊糖純化和精制的目的，并使原工藝簡(jiǎn)化。將微生物用于菊芋提取液除雜的研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，本文對(duì)此進(jìn)行了研究，以期為工業(yè)生產(chǎn)的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫皮菊芋20 kg，購(gòu)于蘭州市某市場(chǎng)。將新鮮菊芋洗凈切片，于60 ℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥24 h，制得菊芋干片，備用；菌株,蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心保藏的11株酵母菌菌株，分離自寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)的葡萄果實(shí)表皮和根際土壤中[15]；菊糖,即菊粉，購(gòu)自甘肅省白銀市某菊粉生產(chǎn)企業(yè)。

YPD培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨20，pH 5.5。

產(chǎn)酶種子培養(yǎng)基，參照文獻(xiàn)[16]略做修改：菊糖10，蛋白胨20，酵母粉10，pH 5.5。

產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)[17]：菊糖30，蛋白胨20，酵母粉10，(NH4)2SO45，KH2PO43，pH 5.5。

WL營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(g/L)[18]：酵母浸粉4，胰蛋白胨5，葡萄糖50，瓊脂20，儲(chǔ)液A(KH2PO45.5 g，KCl 4.25 g，CaCl21.25 g，MgSO41.25 g，定容至400 mL，按1∶25比例添加)，儲(chǔ)液B(FeCl30.25 g，MnSO40.25 g，定容至100 mL，按1∶1 000比例添加)；儲(chǔ)液C(0.44 g溴甲酚綠溶于100 mL體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液中，按1∶1 000比例添加)，1×105Pa滅菌20 min。

牛血清蛋白(BSA，生物試劑)，考馬斯亮藍(lán)(優(yōu)級(jí)純)，蔗糖、果糖、酒石酸鉀鈉、3,5-二硝基水楊酸、苯酚、蒽酮等試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

WPL-125BE型恒溫培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司；UV-3000PC型紫外分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；TGL-16型高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；FA2004型分析天平，上海良平儀器儀表有限公司；SHB-111型真空抽濾泵，天津賽得利斯實(shí)驗(yàn)分析儀器制造廠(chǎng)；GZX-9030MBE型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株鑒定及其菊粉酶活力的測(cè)定

1.3.1.1 菌株初步鑒定[19]

將11株酵母菌分別轉(zhuǎn)接至WL鑒別培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5～7 d，依據(jù)各菌株在WL培養(yǎng)基的菌落形態(tài)和顏色特征等，參照WL培養(yǎng)基的酵母菌鑒別表，進(jìn)行初步鑒定。

1.3.1.2 菊粉酶粗酶液的制備

將11株酵母菌菌株分別接入YPD培養(yǎng)基中，28 ℃活化培養(yǎng)24 h；之后轉(zhuǎn)接入產(chǎn)酶種子培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)12 h；再將種子液轉(zhuǎn)接入50 mL產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中(接種量為10%體積分?jǐn)?shù))，30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)96 h。將發(fā)酵液在3 500 r/min，離心15 min，取上清液即為粗酶液。

1.3.1.3 菊粉酶活力的測(cè)定

首先參照文獻(xiàn)[20]制作標(biāo)準(zhǔn)果糖曲線(xiàn)。

將粗酶液經(jīng)適當(dāng)稀釋后取1 mL，加入20 g/L菊糖(用0.2 mol/L，pH 4.5醋酸緩沖液配制)4 mL，50 ℃下反應(yīng)30 min，沸水加熱5 min滅酶活，采用3,5-二硝基水楊酸法(DNS比色法)[16]測(cè)還原糖，以沸水浴加熱10 min失活的粗酶液作為對(duì)照。在果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出糖含量，計(jì)算反應(yīng)生成的還原糖量(以果糖計(jì))，以每分鐘轉(zhuǎn)化生成 1 μmol/L還原糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位，該法測(cè)得的是內(nèi)切菊粉酶活力，以I表示。以2% 蔗糖代替菊糖，其他步驟同上。以每分鐘轉(zhuǎn)化生成1 μmol/L還原糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位，即為外切菊粉酶活力，以S表示。每個(gè)菌株實(shí)驗(yàn)結(jié)果取3次的平均值。

一般認(rèn)為當(dāng)I/S>10時(shí)，菊粉酶主要表現(xiàn)為內(nèi)切酶活性，而I/S<10時(shí)，主要表現(xiàn)為外切酶活性[21]。

1.3.2 菊糖粗提液的制備

新鮮菊芋洗凈切片，于60 ℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥24 h，得菊芋干片。以粉碎的菊芋干粉為原料，菊糖熱水提取條件為：料液比1∶15(g∶mL)、溫度80 ℃、時(shí)間80 min，重復(fù)提取2次，經(jīng)活性炭脫色，得菊糖粗提液。

1.3.3 酵母菌除雜實(shí)驗(yàn)

1.3.3.1 分析方法

總糖的測(cè)定采用硫酸-蒽酮法；還原糖測(cè)定采用DNS法；蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法，以牛血清白蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[20]。

菊糖=總糖-還原糖

(1)

還 原糖脫除率/%=

(2)

蛋 白質(zhì)脫除率/%=

(3)

菊 糖損失率/%=

(4)

1.3.3.2 單因素試驗(yàn)

將選取的菊粉酶活力較低的酵母菌株先用YPD培養(yǎng)基，28 ℃活化培養(yǎng)24 h，之后轉(zhuǎn)接入已滅菌的菊糖粗提液中，28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)12 h，即為除雜酵母種子液。取40 mL菊糖粗提液于250 mL三角瓶中，經(jīng)滅菌后接入體積分?jǐn)?shù)3%除雜酵母菌種子液，對(duì)培養(yǎng)時(shí)間、溫度以及搖瓶轉(zhuǎn)速進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，測(cè)定菊糖提取液中的還原糖和蛋白質(zhì)的脫除率，確定3個(gè)因素的適宜條件。

1.3.3.3 正交試驗(yàn)

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)間、溫度及轉(zhuǎn)速3因素3水平正交試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化酵母菌除雜條件。按公式(5)計(jì)算:

×0.5

(5)

1.3.3.4 正交試驗(yàn)驗(yàn)證

以正交試驗(yàn)優(yōu)化組合條件進(jìn)行脫除還原糖和蛋白質(zhì)的驗(yàn)證試驗(yàn)；同時(shí)對(duì)在優(yōu)化條件下的菊糖損失率進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 菌株的分類(lèi)學(xué)鑒定

將菌株送到上海生工進(jìn)行測(cè)序，引物用上海生工提供的酵母菌通用引物，得到菌株序列后使用Mega 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)將其進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定及其菊粉酶活力測(cè)定結(jié)果

2.1.1 菌株初步鑒定結(jié)果

依據(jù)11菌株在WL培養(yǎng)基上經(jīng)過(guò)5 d培養(yǎng)后所形成菌落的顏色和形態(tài)特征進(jìn)行鑒定，其中4株為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，編號(hào)S-1-4；3株為有孢漢遜氏酵母(Hanseniasporauvarum)，編號(hào)H-1-3；4株為假絲酵母(Candidaspccies)，編號(hào)Z-1-4。

2.1.2 菌株菊粉酶活力測(cè)定結(jié)果

從表1可以看出，所有測(cè)試菌株的菊粉酶活力普遍低于一些文獻(xiàn)報(bào)道[16-17,22-24]，因菊糖經(jīng)過(guò)菊粉酶的水解作用可以產(chǎn)生果糖或低聚果糖，對(duì)于利用微生物去除菊芋粗提液中單糖的操作是不利的，故要選擇菊粉酶活力較低的菌株。測(cè)定菌株中4株釀酒酵母的內(nèi)切菊粉酶活力(I)均較其他菌株低，其中S-4菌株的I值最低，但其活力比值I/S<10，表現(xiàn)為外切酶活性相對(duì)較高，外切型菊粉酶水解菊糖的產(chǎn)物主要為果糖，對(duì)純化產(chǎn)生不利影響，不適宜作為除雜菌株。S-2菌株的內(nèi)切菊粉酶(I)活力僅高于S-4菌株而低于其他菌株，且其I/S>28，因此選擇S-2作為除雜菌株進(jìn)行以下試驗(yàn)。

表1 酵母菌株菊粉酶活力Table 1 Inulinase activity of yeast strain

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)還原糖和蛋白質(zhì)脫除率的影響

酵母菌培養(yǎng)時(shí)間對(duì)脫除還原糖和蛋白質(zhì)的影響見(jiàn)圖1。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，還原糖和蛋白質(zhì)的脫除率逐漸提高，在50～60 h，脫除率基本穩(wěn)定。由于菊芋熱水粗提液中含有一定量的果糖、葡萄糖、低聚糖及蛋白質(zhì)，可作為酵母菌的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在酵母菌生長(zhǎng)繁殖的前中期，營(yíng)養(yǎng)相對(duì)豐富，酵母菌生長(zhǎng)速率較高，還原糖和蛋白質(zhì)的消耗速率較快，表現(xiàn)為其去除率上升趨勢(shì)明顯，在40 h之后，糖和蛋白質(zhì)逐漸被酵母菌消耗殆盡，脫除率即保持相對(duì)穩(wěn)定；培養(yǎng)至70 h之后，還原糖脫除率基本穩(wěn)定，而蛋白質(zhì)脫除率略有下降，其原因可能是由于酵母菌開(kāi)始老化，部分菌體自溶，菌體蛋白溶入提取液中，導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量略有增加。由此可見(jiàn)，控制適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)時(shí)間對(duì)還原糖和蛋白質(zhì)的脫除是很重要的。

圖1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)除雜的影響Fig.1 Effect of incubation time on impurity removal

2.2.2 培養(yǎng)溫度對(duì)還原糖和蛋白脫除率的影響

溫度對(duì)反應(yīng)體系的影響是多方面的，既影響微生物的生長(zhǎng)繁殖、酶的活性，也會(huì)影響反應(yīng)體系的理化狀態(tài)。通常酵母菌最適的生長(zhǎng)溫度在28～30 ℃，溫度過(guò)低或過(guò)高，都會(huì)影響酵母菌的生長(zhǎng)繁殖，由圖2可知，30 ℃左右也是除雜效果較好的溫度。隨著培養(yǎng)溫度的升高，一方面,酵母菌的生長(zhǎng)將受到不利的影響，特別是在培養(yǎng)初期溫度偏高還將導(dǎo)致中后期菌體早衰，還原糖和蛋白的脫除率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；另一方面，菊粉酶適宜溫度一般為50 ℃左右[25]，溫度升高，酵母菊粉酶活性略有提高，菊糖水解產(chǎn)生少量果糖，在一定程度上使還原糖脫除率下降。

圖2 溫度對(duì)除雜的影響Fig.2 Effect of temperature on impurity removal

2.2.3 轉(zhuǎn)速對(duì)還原糖和蛋白脫除率的影響

酵母菌為兼性厭氧微生物，溶解氧含量較高時(shí)酵母菌進(jìn)行有氧代謝，產(chǎn)能效率較高，生長(zhǎng)繁殖速率較快。搖瓶轉(zhuǎn)速的高低直接影響反應(yīng)體系的供氧量，由圖3可知，隨著轉(zhuǎn)速的增大，溶氧量增加，酵母菌生長(zhǎng)速率加快，還原糖和蛋白脫除率隨之提高；但當(dāng)轉(zhuǎn)速在160 r/min以上時(shí)，酵母菌的生長(zhǎng)繁殖速率趨于穩(wěn)定，表明溶氧量已超過(guò)臨界溶氧濃度，已不再是限制性因素，酵母菌對(duì)糖和蛋白質(zhì)的脫除率也就基本穩(wěn)定。因此搖瓶轉(zhuǎn)速在160～180 r/min較適宜。

圖3 轉(zhuǎn)速對(duì)除雜的影響Fig.3 Effect of rotational speed on impurity removal

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果及分析見(jiàn)表2、表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results of orthogonal tests and rangeanalysis table

注：綜合評(píng)分采用加權(quán)評(píng)分法，分別把2項(xiàng)中最大的指標(biāo)定為100分，權(quán)重系數(shù)均為0.5。

從表2和表3可以看出，酵母菌培養(yǎng)時(shí)間和溫度對(duì)還原糖脫除率的影響極顯著(P<0.01)，而搖床轉(zhuǎn)速在140～180 r/min對(duì)還原糖脫除率影響不顯著；3個(gè)因素對(duì)蛋白質(zhì)脫除率的影響均極顯著(P<0.01)。通過(guò)對(duì)還原糖脫除率和蛋白質(zhì)脫除率的綜合評(píng)分，3個(gè)因素的影響主次順序?yàn)闀r(shí)間>溫度>轉(zhuǎn)速；較優(yōu)組合為A2B2C3。

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 3 Result of variance analysis for orthogonalexperiment

2.4 正交試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

因酵母菌搖床培養(yǎng)時(shí)轉(zhuǎn)速在160～180 r/min對(duì)脫除率綜合影響不顯著，故以較優(yōu)組合A2B2C3和A2B2C2做進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)表4。A2B2C3組合的酵母菌還原糖和蛋白質(zhì)脫除率分別達(dá)92.6%和93.1%，但菊糖損失率略高于A2B2C2組合?？紤]到工業(yè)化培養(yǎng)微生物時(shí)，溶解氧常常是限制性因素，因此可選擇溶氧水平較低的條件，即溫度30 ℃、時(shí)間50 h、轉(zhuǎn)速160 r/min，在此條件下，酵母菌對(duì)還原糖和蛋白質(zhì)的脫除率分別為92.4%和92.9%，菊糖損失率為2.86%，除雜效果達(dá)到或優(yōu)于其他方法[7,12,21-23]。

表4 正交試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果Table 4 Verification results of orthogonal tests

2.5 分類(lèi)學(xué)鑒定結(jié)果

從圖4看出，菌株S-2與來(lái)自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的幾種釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)在一個(gè)進(jìn)化分支上，并且在NCBI中的序列比對(duì)結(jié)果顯示其相似性在98%以上，表明S-2菌株屬于釀酒酵母。

圖4 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)11株酵母菌菌株的菊粉酶酶活力的測(cè)定與分析，篩選出1株菊粉酶活力較低的菌株S-2，且該菌株主要表現(xiàn)為內(nèi)切酶活性。

在對(duì)影響酵母菌脫除還原糖和蛋白質(zhì)的培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度及搖床轉(zhuǎn)速單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了正交試驗(yàn)優(yōu)化及驗(yàn)證，結(jié)果表明，在培養(yǎng)時(shí)間為50 h、溫度30 ℃、搖瓶轉(zhuǎn)速在160～180 r/min條件下，菌株S-2對(duì)還原糖的脫除率大于92%，對(duì)蛋白質(zhì)的脫除率在93%左右，菊糖損失率低于3%。體現(xiàn)出脫雜效果好、菊糖損失少的優(yōu)點(diǎn)，說(shuō)明利用微生物脫除菊芋粗提液中的還原糖和蛋白質(zhì)是可行的。

本實(shí)驗(yàn)所選擇的除雜酵母菌S-2經(jīng)系統(tǒng)鑒定為釀酒酵母，在食品生產(chǎn)中釀酒酵母已被美國(guó)FDA認(rèn)證為GRAS菌株，不存在食品安全問(wèn)題。除雜過(guò)程中培養(yǎng)產(chǎn)生的菌體可做進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用，或可通過(guò)微生物育種，選擇菊粉酶活性低而菌體蛋白含量高的酵母菌株除雜，菌體可作為飼料蛋白添加劑使用。