岳瑩雪，李柏良，宋月，閆芬芬，王玉琦，霍貴成

(乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北農(nóng)業(yè)大學(xué))，黑龍江 哈爾濱，150030)

瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)是革蘭氏陽(yáng)性乳酸桿菌，最適生長(zhǎng)溫度為42℃，通常呈白色或淺灰色不透明狀，在瓊脂平板上菌落的直徑為2～3 mm或更小。同型發(fā)酵產(chǎn)DL-乳酸，在甘露糖和果糖中緩慢的產(chǎn)酸或不產(chǎn)酸[1]。對(duì)瑞士乳桿菌進(jìn)行基因組序列測(cè)序，然后進(jìn)行基因功能的注釋，鑒定基因組編碼區(qū)的未知功能基因，可挖掘其在生物體生命活動(dòng)中起重要作用的新功能因子，這對(duì)其基因組和菌株的益生功能兩方面的研究具有重要的意義[2]。瑞士乳桿菌具有公認(rèn)的安全性和益生特性，在乳品中得到廣泛的應(yīng)用，例如在牛奶中產(chǎn)生大量的乳酸，能夠迅速使奶酪裂解以及表達(dá)復(fù)雜的蛋白水解酶序列[3]。此外，它可作為主要的乳酸菌生產(chǎn)意大利和瑞士奶酪[4]。

本文從基因組特征、益生特性和應(yīng)用3方面綜述了瑞士乳桿菌基因組與益生特性的聯(lián)系，蛋白水解系統(tǒng)及其產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)抗高血壓的益生特性，所產(chǎn)胞外多糖的益生特性，在腸道中和對(duì)宿主的免疫調(diào)節(jié)益生特性。最后，討論了瑞士乳桿菌在食品領(lǐng)域的應(yīng)用及其表面活性劑的應(yīng)用研究進(jìn)展。

1 瑞士乳桿菌基因組特征

有時(shí)對(duì)益生菌的益生機(jī)理尚不能進(jìn)行清楚的解釋，因此，需要通過(guò)基因組學(xué)、蛋白組學(xué)及代謝組學(xué)3方面，從遺傳的角度進(jìn)行分析，以挖掘其潛在的益生特性。截至2018年，在National Center for Biotechnology Information(NCBI)網(wǎng)站能夠查詢到達(dá)到完成圖水平的瑞士乳桿菌13株，見(jiàn)表1。

表1 13株瑞士乳桿菌的全基因組信息Table 1 Genome-wide information on 13 Lactobacillus helveticus

注：“-”表示無(wú)相關(guān)數(shù)據(jù)。

許多研究人員對(duì)瑞士乳桿菌進(jìn)行全基因組分析，以更好地挖掘菌株自身所具有的益生功能。其中，基因組序列顯示：瑞士乳桿菌CAUH18具有新型胞外多糖生物合成的基因簇，同時(shí)含有可在胃腸道中定殖的細(xì)胞表面聚集促進(jìn)因子的基因，該基因組序列為進(jìn)一步研究其益生菌功能和分子遺傳學(xué)提供了基礎(chǔ)[5]。瑞士乳桿菌R0052只攜帶4種細(xì)胞膜包裹相關(guān)蛋白酶之一prtH4[15]，它還具有獨(dú)特的表面層蛋白，已被證明可抑制大腸桿菌O157: H7與人細(xì)胞的黏附[16]。瑞士乳桿菌R0052具有編碼3種黏液結(jié)合蛋白(MUB)前體的基因，這些蛋白質(zhì)在黏附到腸黏液層上發(fā)揮重要的作用，并且這種特殊的瑞士乳桿菌能夠持續(xù)存在于腸道中[7]。瑞士乳桿菌KLDS1.8701具有比其他測(cè)序的瑞士乳桿菌更多的黏液結(jié)合蛋白(HUO_04880，HUO_07225，HUO_07230和HUO_07235)，這表明該菌株可能在腸道有較強(qiáng)的定殖能力，并與腸道微生物如益生菌的相互作用中占有優(yōu)勢(shì)[11]。瑞士乳桿菌MB2-1基因組包含21個(gè)胞外多糖相關(guān)基因，其中10個(gè)基因獨(dú)特地存在于MB2-1，并被認(rèn)為是確定獨(dú)特胞外多糖形成的關(guān)鍵酶。因此，MB2-1最重要的特征之一是具有產(chǎn)生高黏度和高產(chǎn)量胞外多糖的能力[12]。瑞士乳桿菌H9是一種能在牛奶發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生抗高血壓肽的益生菌。利用瑞士乳桿菌的蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組分析牛奶發(fā)酵過(guò)程，證明了某些肽酶和肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)可能是產(chǎn)生這種肽的關(guān)鍵因子[17]。瑞士乳桿菌CNRZ32與瑞士乳桿菌DPC4571[6]，瑞士乳桿菌H10[8]和瑞士乳桿菌R0052[7]的全基因組比較表明，其含有超過(guò)180個(gè)預(yù)測(cè)的編碼序列，而不存在于其他測(cè)序的瑞士乳桿菌中。包括用于磷酸膽堿修飾的胞外多糖生物合成的獨(dú)特基因簇，幾個(gè)基因簇表明CNRZ32至少含有一個(gè)原噬菌體。比較基因組學(xué)也證明，瑞士乳桿菌CNRZ32是唯一測(cè)序的攜帶編碼4種不同細(xì)胞膜蛋白相關(guān)蛋白酶基因的瑞士乳桿菌菌株[15]。

2 瑞士乳桿菌蛋白水解系統(tǒng)及水解肽的抗高血壓益生特性

2.1 蛋白水解系統(tǒng)

乳酸菌的蛋白水解體系是其在牛奶中生長(zhǎng)必不可少的，并且水解對(duì)發(fā)酵乳制品的風(fēng)味也有許多影響，而瑞士乳桿菌被認(rèn)為是對(duì)乳酪蛋白水解最有效的一種，其蛋白水解系統(tǒng)通常由3種類型的組分構(gòu)成：(1)細(xì)胞包膜蛋白酶(CEP)將酪蛋白水解成寡肽；(2)將寡肽轉(zhuǎn)移到細(xì)菌膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)；(3)具有不同和部分重疊特異性的許多細(xì)胞內(nèi)肽酶，形成游離細(xì)胞內(nèi)氨基酸庫(kù)[19]，瑞士乳桿菌蛋白水解系統(tǒng)如圖1所示。

圖1 瑞士乳桿菌蛋白水解系統(tǒng)的示意圖Fig.1 Schematic diagram of Lactobacillus helveticusproteolytic system

但關(guān)于CEP在細(xì)胞表面的位置、PrtM的存在以及寡肽位移的大小仍然存在問(wèn)題。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，瑞士乳桿菌可能擁有1個(gè)或多個(gè)編碼CEP的基因，將酪蛋白水解酶分解成寡肽[18]。根據(jù)生長(zhǎng)培養(yǎng)基的蛋白水解活性差異，瑞士乳桿菌在富含肽或氨基酸的培養(yǎng)基(如MRS)，或在補(bǔ)充有卡索松、卡薩米諾酸的化學(xué)成分確定培養(yǎng)基中，CEP的生物合成能力降低[20]。因此，與MRS培養(yǎng)基相比，在牛奶中生長(zhǎng)的幾種瑞士乳桿菌的CEP活性高9～12倍[21]。對(duì)瑞士乳桿菌SBT11087的CEP活性研究發(fā)現(xiàn)，較少的αS1-酪蛋白由瑞士乳桿菌SBT11087細(xì)胞水解，同時(shí)β-酪蛋白的水解具有特異性，但這種特異性是有限的。降解之后，可在約20 kDa處觀察到條帶，該條帶含有β-酪蛋白的N端RELEE序列，這表明瑞士乳桿菌SBT11087的CEP最初水解的是β-酪蛋白C端區(qū)域。瑞士乳桿菌SBT11087的CEP水解酪蛋白效率低于其他CEP，但對(duì)β-酪蛋白具有特異性[22]。還有研究評(píng)估了4種瑞士乳桿菌ASCC953，ASCC474，ASCC1188和ASCC1315 的蛋白水解活性以及它們釋放生物活性化合物的能力，這些結(jié)果表明，瑞士乳桿菌發(fā)酵的牛奶可能釋放具有重要功能特性的生物活性化合物，這些化合物的特性和活性表現(xiàn)出高度應(yīng)變和發(fā)酵時(shí)間依賴性[23]。

2.2 瑞士乳桿菌水解肽的抗高血壓益生特性

高血壓是心血管疾病的危險(xiǎn)因素之一，包括冠心病，外周動(dòng)脈疾病等。瑞士乳桿菌可以通過(guò)水解乳蛋白來(lái)釋放大量的肽，包括發(fā)酵乳中的生物活性肽，如抗高血壓肽Val-Pro-Pro(VPP)、Ile-Pro-Pro(IPP)和具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換的活性酶(ACE)，其中ACE是控制高血壓的有效靶點(diǎn)[24]。ELFAHRI等[25]研究發(fā)現(xiàn)一種瑞士乳桿菌發(fā)酵乳中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性最高，從開(kāi)始時(shí)的6.33%上升到發(fā)酵結(jié)束時(shí)的48.69%，獲得的結(jié)果與之前的報(bào)道一致，并且明顯高于其他乳酸桿菌。KILPI等[26]研究的野生型瑞士乳桿菌CNRZ32在開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)表現(xiàn)出恒定且相當(dāng)?shù)偷难芫o張素轉(zhuǎn)換的活性酶抑制活性，而在肽酶陰性突變體中，在90 h培養(yǎng)期間活性均勻增加，結(jié)果表明缺失pepN基因的瑞士乳桿菌可能會(huì)延緩短寡肽的水解，從而導(dǎo)致血管緊張素轉(zhuǎn)換的活性酶抑制肽在其水解成更短的肽或游離氨基酸之前暫時(shí)積累。PAN等[27]發(fā)現(xiàn)，通過(guò)3步反相高效液相色譜法對(duì)從瑞士乳桿菌JCM1004 的無(wú)細(xì)胞提取物產(chǎn)生的脫脂乳水解產(chǎn)物進(jìn)行純化，產(chǎn)生了2種有效ACE抑制肽，這2種肽恢復(fù)了75%的初始ACE抑制活性，表明水解產(chǎn)生的大部分ACE活性歸因于這2種肽。通過(guò)序列分析，發(fā)現(xiàn)這2種肽是Val-Pro-Pro(VPP)和Ile-Pro-Pro(IPP)。VPP和IPP顯示出比其他報(bào)道的從奶制品中純化的血管緊張素轉(zhuǎn)換的活性酶抑制肽具有更高的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性。

3 瑞士乳桿菌所產(chǎn)胞外多糖的益生特性

胞外多糖(EPS)是從乳酸菌中分離出來(lái)的最重要組分之一，乳酸菌合成的胞外多糖大多以2種形式存在，一種是莢膜多糖(CPSs)，它附著在細(xì)胞表面，另一種是釋放到細(xì)胞外滲透到培養(yǎng)基中的多糖(EPSs)，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力，是一類效果優(yōu)良的免疫調(diào)節(jié)劑，它與抗氧化劑、抗癌劑、免疫調(diào)節(jié)劑和降膽固醇活性都相關(guān)[28]。LI等[29]研究了LHEPS (純化的胞外多糖組分)的體外抗增殖活性，利用來(lái)自瑞士乳桿菌MB2-1的3種純化LHEPS組分(LHEPS-1，LHEPS-2和LHEPS-3)和粗多糖LHEPS對(duì)人胃癌BGC-823細(xì)胞的增殖潛力進(jìn)行研究，顯示出LHEPS具有潛在應(yīng)用前景，特別是LHEPS-2有可能作為預(yù)防胃癌的功能成分。LI等[30]使用乳清作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對(duì)瑞士乳桿菌MB2-1胞外多糖的最高產(chǎn)量進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)胞外多糖的化學(xué)性質(zhì)、乳化、抗氧化劑和抗菌膜活性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，EPS在不同的油、烴基質(zhì)中表現(xiàn)出優(yōu)異的乳化活性，體外抗氧化測(cè)定顯示胞外多糖具有強(qiáng)抗氧化性，特別是清除羥基和超氧自由基的能力。此外，抑制細(xì)菌生物膜的形成是該胞外多糖的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)。目前，已有研究發(fā)現(xiàn)瑞士乳桿菌MB2-1在發(fā)酵乳制品中具有高黏和酸化的特性，分泌產(chǎn)生的莢膜多糖具有較好的抗氧化能力[31]。

4 瑞士乳桿菌菌體的免疫益生特性

人類腸道是一個(gè)復(fù)雜的環(huán)境，其中有多達(dá)1 000種不同的細(xì)菌會(huì)影響到腸道的上皮細(xì)胞，以及免疫系統(tǒng)[32]。而瑞士乳桿菌具有調(diào)控腸道免疫的益生特性。研究表明，瑞士乳桿菌對(duì)體重增加、行為、腸道微生物群和結(jié)腸細(xì)胞因子分泌的影響取決于小鼠的基因型和飲食[33]。王友湘[34]比較小鼠腸道微生物菌群，分別利用瑞士乳桿菌和大腸桿菌對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，瑞士乳桿菌對(duì)腸道乳酸菌和雙歧桿菌具有增殖的作用，對(duì)大腸桿菌和腸球菌等致病菌的生長(zhǎng)具有抑制作用，能夠降低腸道內(nèi)大腸桿菌的數(shù)量，起到免疫作用，而大腸桿菌對(duì)小鼠腸道黏膜免疫起到反作用。

瑞士乳桿菌還具有調(diào)節(jié)宿主免疫的特性。據(jù)報(bào)道，含有瑞士乳桿菌SBT2171(LH2171)的奶酪具有免疫調(diào)節(jié)作用，包括調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的增加和小鼠中促炎性細(xì)胞因子的減少[35]。KIM等[36]研究的瑞士乳桿菌HY7801在膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎中表現(xiàn)出預(yù)防和治療效果，其主要是在CD4+ T細(xì)胞中上調(diào)IL-10表達(dá)，進(jìn)一步的研究表明腸系膜CD11c+ DCs可能在益生菌誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。瑞士乳桿菌BIM LhM3含有2種不同的噬菌體抗性機(jī)制：抑制噬菌體吸附和一個(gè)I型R/M系統(tǒng)。在瑞士乳桿菌中，噬菌體受體已經(jīng)存在并確定在S層。噬菌體抗性菌株LhM3的S層蛋白質(zhì)序列缺失6個(gè)氨基酸，它修飾了蛋白質(zhì)折疊，結(jié)果表明此菌株干擾了噬菌體對(duì)宿主細(xì)胞的吸附，保護(hù)自己免受噬菌體攻擊[37]。

5 瑞士乳桿菌的應(yīng)用

5.1 瑞士乳桿菌在食品方面的應(yīng)用

瑞士乳桿菌常用于乳制品行業(yè)，制造超硬、半硬和瑞士奶酪發(fā)酵劑或輔助培養(yǎng)物，或用于某些發(fā)酵乳當(dāng)中，現(xiàn)在也廣泛地應(yīng)用于乳酒、食品酸乳飲料及飼料添加劑等發(fā)酵產(chǎn)品中。瑞士乳桿菌可產(chǎn)生許多具有抑菌活性的多肽物質(zhì)，具有抗真菌活性，有研究表明其抗真菌來(lái)源于有機(jī)酸和瑞士乳桿菌KLDS1.8701自身，使其在食品保鮮、防腐和延長(zhǎng)貨架期等方面起著重要的作用[38]。ZHOU[39]等將瑞士乳桿菌H9應(yīng)用于酸奶中，評(píng)價(jià)其在發(fā)酵和儲(chǔ)存中的作用，結(jié)果表明瑞士乳桿菌H9可以促進(jìn)發(fā)酵牛奶的酸化和蛋白水解，從而縮短發(fā)酵時(shí)間并且顯著提高發(fā)酵乳的ACE活性，此結(jié)果將對(duì)乳制品行業(yè)開(kāi)發(fā)新型功能性乳制品具有重要意義。在干酪的生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的乳清，馬玲等[40]利用瑞士乳桿菌和干酪乳桿菌作為益生菌發(fā)酵劑，對(duì)發(fā)酵乳清飲料進(jìn)行了研究。賀志華[1]研究了瑞士乳桿菌發(fā)酵綠豆乳，生產(chǎn)出的產(chǎn)品含有益生菌和豆類乳品2方面的功能特性，是一種新型的低脂肪，高蛋白的功能性乳制品。閔建[41]研究了瑞士乳桿菌和干酪乳桿菌制備大豆酸奶，這種組合比生產(chǎn)普通酸奶的菌株發(fā)酵大豆酸奶的口感要好，并且發(fā)現(xiàn)瑞士乳桿菌與干酪乳桿菌組合發(fā)酵產(chǎn)生的大豆酸奶各方面指標(biāo)也都是最優(yōu)的。因此，將益生菌例如瑞士乳桿菌用于大豆酸奶中是一個(gè)很好的研究方向。瑞士乳桿菌還可以制備凍干發(fā)酵劑，陳岑[42]利用高產(chǎn)黏瑞士乳桿菌MB2-1的凍干發(fā)酵劑制備酸乳并且使用酸乳粉制備具有多種用途的酸乳泡騰片，獲得集咀嚼、泡騰和再制酸乳多個(gè)優(yōu)點(diǎn)于一體的益生酸乳泡騰片。

5.2 瑞士乳桿菌生物表面活性劑的應(yīng)用

生物表面活性劑是具有表面和乳化性質(zhì)的兩親性分子，細(xì)菌附著到表面后形成生物膜，對(duì)食品、環(huán)境和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都具有重要的影響。食品加工環(huán)境中生物膜的產(chǎn)生對(duì)消費(fèi)者的健康有害。有研究表明，生物膜形成導(dǎo)致抗菌產(chǎn)品的抗性增加[43]。SHARMA等[44]對(duì)生物表面活性劑生產(chǎn)及其生物醫(yī)學(xué)和食品應(yīng)用進(jìn)行篩選，結(jié)果表明應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的瑞士乳桿菌MRTL91 的生物表面活性劑，可用于替代抗微生物劑抵抗病原微生物，使其成為常規(guī)抗生素的合適替代物以供在食品和化妝品領(lǐng)域進(jìn)一步使用。

6 展望

瑞士乳桿菌在益生菌中是蛋白水解能力較強(qiáng)的一種菌株，雖然水解酪蛋白產(chǎn)生的抗高壓肽已成為研究的熱點(diǎn)，但細(xì)胞包膜蛋白酶與酪蛋白相互作用的活性和特異性以及細(xì)胞包膜蛋白酶釋放肽的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)還有待深入研究。除了其發(fā)酵產(chǎn)物中產(chǎn)生的抗高血壓肽外，瑞士乳桿菌還產(chǎn)生胞外多糖，利用發(fā)酵條件優(yōu)化、基因和代謝工程的手段尋找高產(chǎn)胞外多糖的瑞士乳桿菌是接下來(lái)要進(jìn)行的工作。由于胞外多糖的結(jié)構(gòu)組成不同，對(duì)其進(jìn)行分離純化、結(jié)構(gòu)解析以及益生功能的研究也是今后的研究方向。瑞士乳桿菌及其代謝產(chǎn)物對(duì)抗氧化、抑菌、炎癥、癌癥等方面的作用已有研究，但對(duì)其發(fā)揮這些益生功能的機(jī)制未徹底研究清楚。利用微生物基因組學(xué)可發(fā)現(xiàn)瑞士乳桿菌中新的基因,并可分析它們所編碼的具有特殊功能的多肽和基因調(diào)控元件,從而加深對(duì)瑞士乳桿菌生命活動(dòng)機(jī)理的重要代謝和調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)，所以在基因水平上的研究有利于瑞士乳桿菌功能基因研究、利用及菌種改良。在產(chǎn)品開(kāi)發(fā)方面需開(kāi)發(fā)新型功能性乳制品以發(fā)揮瑞士乳桿菌的應(yīng)用價(jià)值。綜上所述，瑞士乳桿菌是具有廣闊發(fā)展前景的一種益生菌。