棘胸蛙蝌蚪“腹水病”病原菌分離與鑒定

王會聰，袁九龍，王煜恒，張 坤，陳 軍，章海鑫,2

( 1.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術學院 畜牧獸醫(yī)學院，江蘇 句容 212400； 2.江西水產(chǎn)科學研究所，江西 南昌 330039 )

棘胸蛙(Ranaspinosa)是我國特有的大型兩棲類野生蛙，主要分布在我國南方山區(qū)，是江西省重點保護動物。生活史有蝌蚪期和成蛙期兩個階段，蝌蚪期為3～8個月，生活于水中，用鰓呼吸。由于棘胸蛙具有極高的經(jīng)濟價值和營養(yǎng)保健價值[1]而受到市場的熱烈歡迎，所以人工養(yǎng)殖發(fā)展迅速，規(guī)模逐年增加。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷增大，棘胸蛙病害開始增多，給養(yǎng)殖造成了大量的損失。如2014年鷹潭泉源石蛙養(yǎng)殖有限公司就因“腹水”導致春季蝌蚪大量死亡；2015年江西銅鼓棘胸蛙繁育中心幼蛙發(fā)病導致大量死亡；2016年宜春明月山石蛙股份公司蝌蚪出現(xiàn)“腹水”，成蛙出現(xiàn)“瞎眼”等病癥導致大量死亡。目前，已報道的棘胸蛙疾病有10余種[2]，分別為紅腿病、爛皮病、歪頭病、黑肝病等[3-6]，對于這些疾病的病原和防治方法等均有研究。雖然這些研究解決了很多棘胸蛙養(yǎng)殖中的病害難題，但較少涉及棘胸蛙蝌蚪的疾病研究，棘胸蛙蝌蚪病害研究鮮見報道。棘胸蛙養(yǎng)殖過程中蝌蚪期同樣受到各種疾病的侵害，如宜春明月山石蛙股份公司蝌蚪大量死亡就是因為蝌蚪出現(xiàn)“腹水”等問題導致的。這種“腹水、出血”疾病一般在當年孵化蝌蚪上出現(xiàn)，越冬蝌蚪很少見，出膜后1個月到變態(tài)前這段時間均有發(fā)生。其傳染性強、死亡快，開始蝌蚪聚集在養(yǎng)殖池璧上，然后開始腹部膨脹、心跳加速，部分蝌蚪出現(xiàn)出血，繼而開始死亡，2～3 d后死亡率達到70%。這種疾病對于養(yǎng)殖造成了極大的困難，但目前尚未見有關這種癥狀疾病研究的報道。僅闕炳根[7]介紹了部分棘胸蛙蝌蚪寄生蟲病、紅腿病、爛鰓病、真菌病的一些防治方法，但并未詳細介紹蝌蚪疾病的病原，對于棘胸蛙蝌蚪出現(xiàn)“腹水、出血”等癥狀疾病的研究和防治方法亦未見報道。因此，筆者針對棘胸蛙養(yǎng)殖過程中常見的蝌蚪出現(xiàn)“腹水、出血”等癥狀的疾病進行初步病原學研究，以期找到棘胸蛙蝌蚪“腹水病”病原并為治療這種疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

患病蝌蚪取自宜春市三高綠建農(nóng)業(yè)集團下屬養(yǎng)殖場，該養(yǎng)殖場在2016年和2017年均大面積暴發(fā)了棘胸蛙蝌蚪“腹水病”。蝌蚪表現(xiàn)為腹部脹大、心跳加速、出血、腹水，不攝食等癥狀。蝌蚪體長為(3.5±1.2) cm。健康蝌蚪(規(guī)格同患病蝌蚪)由江西省水產(chǎn)科學研究所育種室提供。試驗所需引物由北京六合華大科技有限公司合成。

主要試劑：普通營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、生化試驗所需試劑盒藥品均購自國藥集團；細菌DNA提取試劑盒購自大連寶生物公司。細菌基因組DNA提取試劑盒、PCR擴增細菌16S rDNA 試劑盒、TaqDNA聚合酶均購自上海生工生物工程技術服務有限公司；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 病原菌分離

在無菌條件下將采集到的患病蝌蚪用75%的酒精體表消毒后解剖，分別將在肝臟、腹水和鰓部采集到的細菌接種于營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h。挑取形態(tài)、顏色、大小等一致且數(shù)量占優(yōu)勢的菌株進一步純化培養(yǎng)。純化2次后接種于營養(yǎng)瓊脂斜面，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。同時將優(yōu)勢菌株培養(yǎng)液與等體積50%甘油混合，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 人工感染試驗

1.3.1 菌株毒性研究

選取健康的棘胸蛙蝌蚪在23 ℃水溫條件下暫養(yǎng)7 d后，分組飼養(yǎng)于 90 cm×60 cm×30 cm的玻璃缸中，每日正常投喂蝌蚪飼料，保持滴水，水溫為22～24 ℃。將純化出來的病原菌擴大培養(yǎng)，用無菌生理鹽水配制成菌懸液。將菌懸液制成密度分別為0(生理鹽水為對照)、2.8×104、2.8×105、2.8×106、2.8×107、2.8×108、2.8×109cfu/mL的菌液，用砂紙輕輕摩擦蝌蚪皮膚使之具有輕微傷痕，將劃傷蝌蚪分別放入各密度菌液中，浸泡20 min后放入原水缸中進行暫養(yǎng)，每個密度菌液10尾蝌蚪，每個菌液重復3次。觀察每個水缸中蝌蚪的死亡情況。并使用Bliss法[8]計算24、48、96 h菌株半數(shù)致死密度。

1.3.2 蝌蚪回感試驗

使用病原菌48 h半數(shù)致死密度進行回感試驗。用砂紙輕輕摩擦蝌蚪皮膚使之具有輕微傷痕，將劃傷蝌蚪分別放入各密度菌懸液中，浸泡20 min，對照組在0.65%生理鹽水中浸泡20 min，然后分別放入原水缸，每缸10尾，每日記錄蝌蚪活動情況。并從感染患病個體分離細菌進行純化研究，根據(jù)柯赫法則確定病原菌。

1.4 病原菌鑒定

1.4.1 生化鑒定

病原菌經(jīng)進一步純化后，進行革蘭氏染色并參照文獻[5]的方法進行形態(tài)學和生理生化檢測鑒定。生化鑒定管及相關試劑均購自杭州微生物有限公司。

1.4.2 分子鑒定

參照文獻[9]方法對病原菌進行分子鑒定，16S rDNA序列PCR擴增，克隆轉化后的陽性克隆送上海生工進行核苷酸序列測定。將菌株測定的16S rDNA序列與美國國立生物技術信息中心數(shù)據(jù)庫中細菌的16S rDNA進行比對。采用Clustal w軟件進行多序列匹配分析，用Mega 6.0軟件包中的鄰接法構建系統(tǒng)進化樹，通過1000次自舉檢驗置信度，鑒定病原菌的種類。

1.5 藥敏試驗

藥敏試驗采用K-B法，將菌株接種于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基，于28 ℃搖床培養(yǎng)20 h后分別涂布營養(yǎng)瓊脂平板。選擇24種藥敏紙片均勻貼于平板，每個平板貼5片，28 ℃下培養(yǎng) 24 h后測量抑菌圈直徑。參照抗菌藥物敏感試驗標準[8]確定各種藥物對病原菌株的敏感性。

2 結 果

2.1 病原的分離與回感

2017年7—8月自患病蝌蚪肝臟中分離到細菌4株，分別命名為JK-1、JK-2、JK-3、Jb-1。其中菌株JK-1、JK-2為大菌落，菌株JK-3、Jb-1為小菌落；JK-3菌株菌落黏性較大，接種環(huán)易拉成絲，呈灰白色。預試驗得知菌株JK-3對蝌蚪有致死能力。對菌株JK-3進行毒性研究，其24、48、96 h半數(shù)致死密度分別為1.2×108、1.2×107、0.8×106cfu/mL(表1)。用菌株JK-3的48 h半數(shù)致死密度進行回感試驗，結果見表2。蝌蚪在菌株JK-3密度1.2×107cfu/mL菌液中浸泡20 min后，蝌蚪48 h后出現(xiàn)腹部脹大、心跳加速、體表出血以及腹水等癥狀，并開始死亡，120 h時已經(jīng)死亡6尾(圖1)。對患病蝌蚪分離細菌得到與菌株JK-3菌落形態(tài)一致的菌株。

2.2 生化鑒定結果

對菌株JK-3進行革蘭氏染色，染色結果顯示，該菌株為革蘭氏陰性菌，具莢膜，桿狀。同時選取21種生化指標進行生化測定，各項指標測定結果(表3)表明，所有生化指標與《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)指標基本一致，初步判斷所分離的病原菌JK-3為肺炎克雷伯菌。

2.3 16S rDNA基因同源性分析

病原菌JK-3所擴增的16S rDNA基因序列長度約為1482 bp，對其測序并提交至GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫，登錄號為KJ150720.1。將其通過美國國立生物技術信息中心的Blastn檢索系統(tǒng)進行序列同源性分析，構建系統(tǒng)進化樹(圖3)，結果表明，該菌株與克雷伯菌屬細菌的16S rDNA基因序列自然聚類，JK-3菌株與檢索出的肺炎克雷伯菌聚為一支，相似性最高為99.5%。結合生化鑒定結果，確定菌株JK-3為肺炎克雷伯菌。

表1 JK-3毒性試驗結果

表2 細菌回感試驗結果

圖2 菌株JK-3 提取DNA電泳圖

項目結果項目結果接觸酶+明膠液化+氧化酶-葡萄糖發(fā)酵+H2S-蔗糖+吲哚-甘露醇+甲基紅-麥芽糖+靛基質(zhì)-鳥氨酸脫羧酶-Vp+精氨酸-反硝化+賴氨酸脫羧酶+脲素+奶糖發(fā)酵+丙二酸鹽+鳥氨酸-硝酸鹽還原+

注：“+”為陽性；“-”為陰性.

2.4 藥敏試驗結果

參照文獻[10]對肺炎克雷伯菌JK-3進行藥敏試驗，結果見表4。肺炎克雷伯菌JK-3對美滿霉素、丁胺卡那、復達欣、哌拉西林、慶大霉素、先鋒必素、先鋒Ⅳ敏感，對其他藥物耐藥或中度耐藥。

表4 菌株藥敏試驗結果

注：S表示抑菌圈≥21 mm，為敏感，R表示抑菌圈為≤15 mm，為耐藥，I 表示抑菌圈為16～20 mm，為中度耐藥.

圖3 菌株JK-3 16S rDNA基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討 論

細菌感染是引起蛙類病害的主要原因之一，如壺菌(Batrachochytriumdendrobatidis)感染可引起東北林蛙(R.dybowskii)患壺菌病[11]，腦膜炎敗血癥黃桿菌(Flavobacteriummeningitidis)可引起虎紋蛙(R.tigrinarugulosa)患白內(nèi)障[12]，嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)可引起牛蛙(R.catesbeiana)患紅腿病[13]，棘胸蛙爛皮病由奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)引起[5]。棘胸蛙蝌蚪“腹水病”發(fā)病初期腹部脹大，繼而心跳加快，隨后體表出血，腹部有腹水，傳染速度很快，短時間即能引起棘胸蛙蝌蚪大量死亡，主要流行于夏季。自患病蝌蚪內(nèi)臟中分離到4株細菌，同時回感健康蝌蚪，菌株JK-3感染的蝌蚪出現(xiàn)腹部脹大、心跳加快、體表出血和腹水等癥狀，分離菌株形態(tài)與菌株JK-3一致。經(jīng)生化鑒定，菌株JK-3與肺炎克雷伯氏菌[14-15]基本一致；16S rDNA鑒定結果表明，菌株JK-3與肺炎克雷伯菌相似性達99.5%。因此確定肺炎克雷伯菌JK-3是棘胸蛙蝌蚪“腹水病”病原菌之一。鄭善堅[16]利用梅里埃細菌生化鑒定儀快速鑒定了另一例棘胸蛙蝌蚪腹水病(腹腔鼓脹呈圓球形，類似氣泡病，肝臟發(fā)紅或發(fā)黃，腸道透明無食)病原為溫和氣單胞菌(A.sobria)。肺炎克雷伯菌[17]與溫和氣單胞菌[16]均為條件致病菌，因此在條件合適的情況下并不排除兩種細菌均能導致棘胸蛙蝌蚪患病的可能。

克雷伯菌是革蘭氏陰性桿菌，主要有肺炎克雷伯菌、臭鼻克雷伯菌(K.ozaenae)和鼻硬結克雷伯菌(K.rhinoscleromatis)，其中廣泛存在于水、土壤和谷物中，是陸生動物呼吸道和腸道內(nèi)寄生性致病菌，常引起肺炎、泌尿系統(tǒng)疾病，創(chuàng)傷感染敗血癥等[17]，在雞、鼠等動物身上均有分離到[18-19]。在水生動物中也漸有報道，如Singh等[20]在魚、蝦、蟹等食品中檢測到肺炎克雷伯菌，研究發(fā)現(xiàn)，肺炎克雷伯菌能引起中華鱉(Trionyxsinensis)[14]、鰻鱺(Anguillajaponica)[21]、鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)[22]和黃喉擬水龜(Mauremysmutica)[23]患細菌性疾病，表明肺炎克雷伯菌同樣是水生動物致病菌之一。筆者首次在兩棲蛙類(棘胸蛙)蝌蚪體內(nèi)分離到肺炎克雷伯菌，并能引起蝌蚪出現(xiàn)“腹水和出血”等癥狀，死亡率高，具有較高的致病力。由藥敏結果可知，分離到的肺炎克雷伯菌JK-3對美滿霉素、丁胺卡那、復達欣、哌拉西林、慶大霉素、先鋒必素、先鋒Ⅳ具有一定的敏感性。除慶大霉素外，其余藥物均禁止用于水產(chǎn)動物，所以在臨床用藥中只有慶大霉素能夠使用?？捎门R床藥物種類少可能也是這種疾病大面積暴發(fā)的原因之一，所以“腹水病”應防大于治，在平日養(yǎng)殖過程中應注意消毒，切斷傳染源是預防該細菌性疾病的關鍵所在。