付紹鴻，趙榮壽，楊 柳，周 藺

（四川省古藺郎酒廠有限公司，四川古藺646523）

“曲是酒之骨”，酒曲的好壞直接影響著酒的產(chǎn)量和質(zhì)量。不同類型大曲內(nèi)微生物和酶類的組成與其具體的制曲生產(chǎn)工藝和地理環(huán)境息息相關(guān)。從宏觀上看，不同香型大曲之間的差異主要是受環(huán)境條件（溫度、濕度等環(huán)境因素）和制曲工藝措施的影響；從微觀角度看，其本質(zhì)是受各大曲中微生物種群組成和豐度，以及由此產(chǎn)生的符合酶系組分配比差異的影響。因此，從微生物學(xué)角度比較不同香型間的相互作用規(guī)律，具有較為重要的意義。

高通量測序技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的具有里程碑式的測序技術(shù)，其在微生物生態(tài)學(xué)研究中具有無可比擬的優(yōu)勢，隨著測序費(fèi)用的降低，該技術(shù)越來越多的替代DGGE、ARDRA等傳統(tǒng)免培養(yǎng)技術(shù)。本文通過最新的高通量測序技術(shù)，對(duì)郎酒高溫大曲制曲及儲(chǔ)藏階段微生物區(qū)系變化開展研究，為指導(dǎo)高溫大曲功能微生物篩選應(yīng)用、優(yōu)化提升大曲制作工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

高溫大曲樣品：取自四川省古藺郎酒廠有限公司，分別為入倉、翻曲、儲(chǔ)存1個(gè)月、儲(chǔ)存2個(gè)月4個(gè)時(shí)間段的同一批樣品。塊狀曲藥取樣方法采用分層法，粉碎后曲藥取樣采用四分法。

儀器設(shè)備：2P-200型恒溫振蕩器，江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；YM-1000CT恒溫超聲儀，上海豫明儀器有限公司；TGL20M-Ⅱ冷凍離心機(jī)，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；5810R臺(tái)式冷凍離心機(jī)，德國Ep-pendorf公司；2720 thermal cycler PCR儀，Applied Biosysterms；DYCP-31 DNA電泳槽，北京六一儀器廠；DYY-5穩(wěn)壓電泳儀，北京六一儀器廠；FR980凝膠成像儀，上海復(fù)日科技儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大曲總DNA提取

大曲DNA提取方法參照葉光斌等的提取方法。

1.2.2 細(xì)菌的PCR擴(kuò)增

細(xì)菌16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增所用引物為338F（5’-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’）/806R（5’-ACT CTA CHV GGG TWT CTAAT-3’）；PCR反應(yīng)體系為：PCR緩沖液（5×FastPfu Buffer）0.4 μL，2.5 mM dNTPs 0.2 μL，正反向引物（5 μM）各0.8 μL，DNA聚合酶（FastPfu Polymerase）0.4 μL，BSA0.2 μL，模板DNA10 ng，加雙蒸水補(bǔ)齊至20 μL；PCR反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性3 min，以下27個(gè)循環(huán)包括95℃預(yù)變性30 s；然后55℃退火30 s；72℃延伸45 s，最后一個(gè)循環(huán)72℃延伸10 min。通過對(duì)原始數(shù)據(jù)的篩選審查，得到優(yōu)化序列，從而使序列質(zhì)量提高，使分析的結(jié)果更具有可靠性。利用測序平臺(tái)通過雙末端測序（PE sequencing），可以將基因序列進(jìn)行初級(jí)篩選，剔除測序質(zhì)量較差的數(shù)據(jù)。通過barcode找對(duì)應(yīng)編號(hào)樣本，去掉引物，再把質(zhì)量較差的序列剔除?；谛蛄邢嗨贫鹊姆椒?，用Mothur等軟件將序列劃分為不同的OTU；對(duì)于核糖體序列，通常以≥97%的相似度確定為同一OTU。用RDP數(shù)據(jù)庫當(dāng)中序列的集合做對(duì)比，對(duì)單個(gè)OTU的分類信息進(jìn)行歸類。通過獲取OTU信息，可以對(duì)文庫進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序及數(shù)據(jù)分析

經(jīng)檢測及PCR擴(kuò)增，大曲DNA含量及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果見表1和圖1。

從表1和圖1可看出，大曲樣品均獲得有效提取和有效擴(kuò)增，可滿足后續(xù)高通量測序要求。

2.2 高通量原始數(shù)據(jù)獲取

通過對(duì)21個(gè)樣品細(xì)菌16S rRNA基因文庫的高通量測序，共獲得662525條序列，每個(gè)文庫均獲得20000條以上的測序序列，有效的保證了測序的覆蓋率；各文庫的覆蓋率均達(dá)到99.9%以上。各樣品測序數(shù)目、OTU數(shù)目、文庫覆蓋率和香農(nóng)多樣性指數(shù)見表2。

表1 不同大曲樣品提取的DNA含量及OD值檢測

圖1 大曲PCR擴(kuò)增結(jié)果和膠回收結(jié)果

從表2看出，隨著大曲發(fā)酵時(shí)間的推進(jìn)，大曲內(nèi)細(xì)菌的多樣性呈現(xiàn)波浪形變化，OTU數(shù)目在53～131之間，香農(nóng)多樣性指數(shù)在1.13～2.25之間。其中樣品7的細(xì)菌多樣性最為豐富，樣品18的樣品多樣性最少。

2.3 不同大曲樣品細(xì)菌多樣性分析

為了得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息，采用RDP數(shù)據(jù)庫對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并在各個(gè)水平統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的群落組成。選擇細(xì)菌16s細(xì)菌核糖體數(shù)據(jù)庫Silva作為參比數(shù)據(jù)庫。分別在門、綱、目、科、屬的層次下對(duì)各樣品的物種分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（見圖2—圖6）。

從圖2可以看出，樣品1—3的微生物種群主要是厚壁菌門和變形桿菌門微生物，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，放線菌門的出現(xiàn)，變形菌門降低，到了發(fā)酵后期，厚壁菌門成為主要優(yōu)勢種群。

圖2 不同大曲樣品門級(jí)水平分布

由此可得，厚壁菌門在整個(gè)大曲發(fā)酵過程和儲(chǔ)存中起關(guān)鍵作用，而變形菌門在發(fā)酵前期作用較明顯。

圖3 不同大曲樣品綱級(jí)水平分布

如圖3所示，在綱級(jí)水平上，1—3號(hào)大曲占優(yōu)勢的為芽孢桿菌綱和變形桿菌綱，4—9號(hào)大曲占優(yōu)勢為芽孢桿菌綱和放線菌綱，在整個(gè)發(fā)酵和儲(chǔ)存過程中芽孢桿菌綱的豐度值最高，約占全部物種的90%以上。

由此可得，芽孢桿菌綱在整個(gè)大曲發(fā)酵過程和儲(chǔ)存中起關(guān)鍵作用，而變形桿菌綱在發(fā)酵前期作用較明顯。

如圖4所示，在目級(jí)水平上，大曲發(fā)酵前期乳桿菌目和腸桿菌目占優(yōu)勢，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，芽孢桿菌目的豐度值逐漸增大，發(fā)酵中后期約占全部物種的90%以上。

圖4 不同大曲樣品目級(jí)水平分布

由此可得，芽孢桿菌目在整個(gè)大曲發(fā)酵中后期過程和儲(chǔ)存中起關(guān)鍵作用。發(fā)酵前期起主要作用的是乳桿菌目。

圖5 不同大曲樣品科級(jí)水平分布

如圖5所示，大曲發(fā)酵前期腸桿菌科、乳桿菌科和明串珠菌科占優(yōu)勢，隨著大曲發(fā)酵的逐漸推進(jìn)，發(fā)酵中后期和儲(chǔ)存過程中，芽孢桿菌科和高溫放線菌科豐度值逐漸增加。

由此可得，腸桿菌科、乳桿菌科和明串珠菌科主要作用于大曲發(fā)酵前期，芽孢桿菌科和高溫放線菌科在大曲發(fā)酵中后期和儲(chǔ)存過程中起關(guān)鍵作用。

如圖6所示，大曲發(fā)酵前期乳桿菌屬和魏斯氏菌屬占優(yōu)勢，隨著大曲發(fā)酵的逐漸推進(jìn)，發(fā)酵中期厭氧芽胞桿菌屬和糖多孢菌屬占優(yōu)勢，發(fā)酵后期及儲(chǔ)存過程中，Lentibscillus和Kroppenstedtia占主要優(yōu)勢。

圖6 不同大曲樣品屬級(jí)水平分布

3 結(jié)論

本文利用高通量測序技術(shù)對(duì)發(fā)酵和儲(chǔ)存過程中的微生物區(qū)系變化進(jìn)行了初步分析，分析結(jié)果顯示：

（1）隨著大曲發(fā)酵時(shí)間的推進(jìn)，大曲內(nèi)細(xì)菌的多樣性呈波浪形變化；

（2）在門級(jí)水平上，厚壁菌門在整個(gè)大曲發(fā)酵過程和儲(chǔ)存中起關(guān)鍵作用，而變形菌門在發(fā)酵前期作用較明顯；在綱級(jí)水平上，芽孢桿菌綱在整個(gè)大曲發(fā)酵過程和儲(chǔ)存中起關(guān)鍵作用，而變形桿菌綱在發(fā)酵前期作用較明顯；在目級(jí)水平上，大曲發(fā)酵前期乳桿菌目和腸桿菌目占優(yōu)勢，芽孢桿菌目在整個(gè)大曲發(fā)酵中后期過程和儲(chǔ)存中起關(guān)鍵作用；在科級(jí)水平上，腸桿菌科、乳桿菌科和明串珠菌科主要作用于大曲發(fā)酵前期，芽孢桿菌科和高溫放線菌科在大曲發(fā)酵中后期和儲(chǔ)存過程中起關(guān)鍵作用；在屬級(jí)水平上，乳桿菌屬和魏斯氏菌屬在大曲發(fā)酵前期占優(yōu)勢，厭氧芽胞桿菌屬和糖多孢菌屬在大曲發(fā)酵中期占優(yōu)勢，Lentibscillus和Kroppenstedtia在大曲發(fā)酵后期及儲(chǔ)存過程中占優(yōu)勢。