范氏法與王玉萬(wàn)法植物纖維素測(cè)定方法探討

李朝英，鄭路,2*，莫世宇

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心，廣西 憑祥 532600； 2.廣西友誼關(guān)森林生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家定位觀測(cè)研究站，廣西 憑祥 532600)

纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分之一。纖維素含量是評(píng)價(jià)植物細(xì)胞機(jī)械組織發(fā)達(dá)程度及作物抗倒伏、抗病蟲(chóng)害能力的主要依據(jù)，還是鑒定糧食、蔬菜及纖維作物產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)。纖維素是自然界最為豐富的可再生資源，在造紙、涂料、聚合物等方面有廣泛應(yīng)用[1-3]。纖維素準(zhǔn)確定量分析方法的建立對(duì)纖維素的開(kāi)發(fā)利用有著重要作用。當(dāng)前，纖維素含量測(cè)定方法主要有NREL法、王玉萬(wàn)法、范氏法。NREL法所用的高效液相色譜儀可對(duì)不同極性或不同比例溶液中的多種成分進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)分析，但儀器昂貴，尚未普及。王玉萬(wàn)法和范氏法以蒽酮比色法或重量法檢測(cè)纖維素含量，檢測(cè)設(shè)備簡(jiǎn)單，適用于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室[4-5]。其中，蒽酮法的測(cè)定原理是，纖維素為β-葡萄糖殘基組成的多糖，在酸性條件下加熱分解的β-葡萄糖與蒽酮脫水縮合，生成黃色的糠醛衍生物，由其顏色深淺可定量測(cè)定纖維素含量高低。重量法的測(cè)定原理是，將樣品經(jīng)酸性洗滌劑消煮所得酸性洗滌纖維(ADF)加硫酸水解纖維素，抽濾清洗后殘?jiān)cADF的差值即為纖維素含量[6-7]。

現(xiàn)期研究多以范氏法檢測(cè)飼料等植物纖維素、膳食纖維素含量，但有關(guān)范氏法測(cè)定纖維素含量的影響因素的討論分析尚未見(jiàn)報(bào)道。同時(shí)，重量法和蒽酮比色法測(cè)定纖維素含量的比較分析也未見(jiàn)報(bào)道。王玉萬(wàn)法與范氏法在測(cè)定纖維素時(shí)，樣品消煮用的洗滌劑、消煮時(shí)間及消煮方式均不同，兩種方法的樣品處理程序?qū)w維素測(cè)定結(jié)果的影響尚不明確。鑒于此，本試驗(yàn)對(duì)范氏法中樣品消煮時(shí)間及硫酸濃度、加硫酸靜置時(shí)間進(jìn)行討論分析，探討影響范氏法測(cè)定纖維素含量的因素，同時(shí)對(duì)比分析范氏法-重量法和范氏法-蒽酮法、王玉萬(wàn)法-重量法和王玉萬(wàn)法-蒽酮法測(cè)定植物纖維素的含量，以期為實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)確測(cè)定植物纖維素含量，科學(xué)選擇適宜的測(cè)定方法提供可行的參考指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

硫酸，丙酮，十六烷三甲基溴化銨，酸性洗滌劑(20 g十六烷三甲基溴化銨溶于1 000 mL的0.5 mol·L-1硫酸中)，十氫化萘，丙酮，蒽酮，葡萄糖，中性洗滌劑(18.6 g乙二胺四乙酸二鈉和6.8 g硼酸溶于少量水中，加入含有30 g十二烷基硫酸鈉和10 mL乙二醇乙醚、4.56 g無(wú)水磷酸氫二鈉的溶液，定容至1 000 mL)。以上試劑均為分析純級(jí)別。

電子分析天平(精確至十萬(wàn)分之一克)，石墨加熱板，真空泵，馬弗爐，烘箱，F(xiàn)ibertec8000纖維素分析儀。

1.2 樣品采集與處理

2017年4月于廣西友誼關(guān)森林生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家定位觀測(cè)研究站在熱帶林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心伏波實(shí)驗(yàn)場(chǎng)采集馬尾松(Pinusmassoniana)人工林內(nèi)的馬尾松側(cè)枝(以下簡(jiǎn)稱馬枝)、2年生桉樹(shù)(Eucalyptusrobusta)人工林內(nèi)的桉樹(shù)側(cè)枝(以下簡(jiǎn)稱桉枝)、佛肚竹(Bambusaventricosa)側(cè)枝(以下簡(jiǎn)稱竹枝)，以及林緣生長(zhǎng)的鬼針草(Bidenspilosa)全株(以下簡(jiǎn)稱草株)。植物樣品在干燥箱中65 ℃烘干后粉碎，過(guò)18目篩(粒徑≤1 mm)，裝袋保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 范氏法-重量法

稱取樣品0.250 0 g，加入25 mL酸性洗滌劑，加5滴十氫化萘，瓶口加漏斗，保持小沸一定時(shí)間，趁熱倒入已知質(zhì)量的G2玻璃坩堝抽濾，并用熱水沖洗殘?jiān)翞V液無(wú)泡沫且呈中性。用丙酮沖洗殘?jiān)翞V液呈無(wú)色，抽凈丙酮并烘干稱重。倒入3 mL的72%硫酸，如硫酸滲濾下去則及時(shí)補(bǔ)加，室溫放置3 h后用熱水沖洗到中性，收集濾液，并定容到200 mL。殘?jiān)?05 ℃烘箱中烘干稱重，計(jì)算含量。

按上述方法進(jìn)行操作，將消煮時(shí)間分別設(shè)置為1.0、1.5、2.0 h，或?qū)⒘蛩釢舛确謩e設(shè)置為68%、70%、72%、75%，進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。

1.3.2 王玉萬(wàn)法-重量法

稱取樣品0.500 0 g，加入50 mL中性洗滌劑，在100 ℃高壓鍋中保溫1 h，以2號(hào)砂芯漏斗過(guò)濾至濾液呈中性，殘?jiān)帽磧纱?。殘?jiān)D(zhuǎn)移到50 mL比色管中，加入50 mL的2 mol·L-1鹽酸溶液，100 ℃高壓鍋保溫50 min，以G2砂芯坩堝過(guò)濾至濾渣呈中性，用丙酮洗2次，加入72%硫酸5 mL，常溫水解3 h，加水45 mL，室溫過(guò)夜。之后烘干、稱重、灰化操作同1.3.1節(jié)。

1.3.3 范氏法-蒽酮法

將1.3.1節(jié)收集的濾液抽取1 mL，稀釋至10 mL。抽取1 mL，加入4 mL蒽酮試劑，沸水浴10 min，冷卻后于620 nm處測(cè)定。抽取0.1 mg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL，分別加入1、0.8、0.6、0.4、0.2 mL水，補(bǔ)足1 mL，加4 mL蒽酮試劑，沸水浴10 min，冷卻后于620 nm處測(cè)定，所測(cè)結(jié)果乘以0.9。

1.3.4 王玉萬(wàn)法-蒽酮法

將1.3.2節(jié)收集的濾液抽取1 mL，同1.3.3節(jié)重復(fù)操作。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003軟件進(jìn)行整理及繪圖，使用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 消煮時(shí)間對(duì)范氏法-重量法測(cè)定的影響

由圖1可見(jiàn)，消煮1 h所測(cè)ADF及纖維素含量偏高，消煮1.5 h所測(cè)ADF及纖維素含量有所下降，與消煮2 h的趨于一致。這是因?yàn)椋簶悠废? h時(shí)，其中的多糖物質(zhì)未被酸性洗滌劑充分溶解，導(dǎo)致所測(cè)ADF中包含了殘留的多糖物質(zhì)，加硫酸后，殘留多糖及纖維素水解，故所測(cè)纖維素偏高；樣品消煮1.5～2 h，植物組織中的多糖物質(zhì)溶解充分，加硫酸后，纖維素水解充分，所測(cè)纖維素含量不受多糖干擾，故所測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確。

圖1 不同消煮時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

消煮1 h所測(cè)ADF及纖維素的標(biāo)準(zhǔn)差均>2%，而消煮1.5～2 h所測(cè)ADF及纖維素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差均<2%，這說(shuō)明消煮1.5～2 h后，測(cè)定的ADF及纖維素含量離散度較小，誤差較小?？梢?jiàn)，樣品消煮1.5～2 h有利于纖維素含量的準(zhǔn)確測(cè)定。

2.2 硫酸濃度對(duì)范氏法-重量法測(cè)定的影響

由圖2可見(jiàn)，加68%、70%硫酸時(shí)所測(cè)纖維素偏低，加72%、75%硫酸時(shí)所測(cè)纖維素含量結(jié)果較一致。這可能是因?yàn)?8%、70%的硫酸未能充分水解纖維素，72%、75%的硫酸水解纖維素更充分。同時(shí)，加68%、70%硫酸所測(cè)纖維素的標(biāo)準(zhǔn)差>2%，而加72%、75%硫酸所測(cè)纖維素的標(biāo)準(zhǔn)差<2%。說(shuō)明用72%、75%硫酸所測(cè)的纖維素含量離散度小，檢測(cè)精密度更優(yōu)。

圖2 不同濃度硫酸對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

2.3 不同方法測(cè)定結(jié)果的比較

由表1可見(jiàn)，范氏法-重量法與王玉萬(wàn)法-重量法所測(cè)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均<4%，而范氏法-蒽酮法與王玉萬(wàn)法-蒽酮法的標(biāo)準(zhǔn)偏差均>4%?？梢?jiàn)，范氏法-重量法與王玉萬(wàn)法-重量法所測(cè)結(jié)果的精密度優(yōu)于范氏法-蒽酮法與王玉萬(wàn)法-蒽酮法。整體來(lái)看，重量法所測(cè)結(jié)果大于蒽酮法的，尤其是在草株上，重量法的測(cè)定結(jié)果顯著高于蒽酮法。重量法操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)誤差易于控制。蒽酮法的待測(cè)液來(lái)自重量法的檢測(cè)系統(tǒng)，但后續(xù)操作煩瑣，檢測(cè)干擾多且不易控制，檢測(cè)誤差高于重量法。

表1 不同方法的測(cè)定結(jié)果對(duì)比 %

注：同行數(shù)據(jù)后無(wú)相同字母的表示差異顯著(P<0.05)。

對(duì)范氏法與王玉萬(wàn)法以重量法所測(cè)的纖維素含量作擬合(圖3)，2種方法所測(cè)結(jié)果趨勢(shì)一致，相關(guān)性良好。這說(shuō)明王玉萬(wàn)法與范氏法以不同洗滌劑及程序處理樣品，但兩者均能充分溶解植物組織中的多糖，避免殘留在ADF中，不致對(duì)纖維素含量測(cè)定造成干擾。

圖3 范氏法與王玉萬(wàn)法所測(cè)纖維素含量的相關(guān)性

3 小結(jié)與討論

本研究表明，范氏法-重量法測(cè)定纖維素時(shí)，樣品適宜的消煮時(shí)間為1.5～2 h，適宜的硫酸濃度為72%～75%。范氏法與王玉萬(wàn)法以重量法所測(cè)纖維素含量結(jié)果趨于一致，精密度良好。重量法操作簡(jiǎn)單，易于控制，精密度高于蒽酮法，是測(cè)定植物纖維素的優(yōu)選方法。

GB/T 20805—2006和GB/T 2677.8—1994多以稻殼、花生殼類農(nóng)副產(chǎn)品為樣品，消煮1 h后，以72%硫酸水解纖維素。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，適宜消煮時(shí)間長(zhǎng)于1 h。這是因?yàn)楸驹囼?yàn)以喬木為樣品，組織細(xì)胞致密，洗滌劑浸潤(rùn)擴(kuò)散用時(shí)長(zhǎng)；而以往研究多以稻殼、花生殼類農(nóng)副產(chǎn)品為樣品，這類樣品的組織細(xì)胞疏松，洗滌劑易于浸潤(rùn)。本試驗(yàn)提出的消煮時(shí)間適用的樣品范圍更廣泛。本試驗(yàn)提出的硫酸濃度范圍較以往研究寬泛，更有利于操作。蒽酮法中，顯色劑配制時(shí)間長(zhǎng)短及加入快慢等都會(huì)影響檢測(cè)，且顯色劑專一性差，纖維素水解過(guò)程中木糖也隨之水解，會(huì)干擾檢測(cè)。因此，蒽酮法的檢測(cè)誤差難以避免，且重復(fù)性較重量法欠佳[8-10]。