李 梁 唐書澤 楊盼盼 劉倩妤 吳事正

(暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632)

飲用水安全對(duì)居民生命健康至關(guān)重要，從飲用水供應(yīng)處到食品企業(yè)和居民區(qū)經(jīng)歷的環(huán)節(jié)復(fù)雜[1]，存在人為投毒和突發(fā)性污染的安全隱患[2]。國(guó)家對(duì)化工污染物和農(nóng)藥等有毒有害試劑有很嚴(yán)格的管制措施[3]，但是由天然動(dòng)植物毒素造成的人為投毒和突發(fā)污染易被忽視[4]。

谷物如稻谷、麥粒、玉米等在潮濕的環(huán)境下極易發(fā)霉，其中的赭曲霉在生長(zhǎng)的過(guò)程中容易產(chǎn)生和積累赭曲霉毒素A (ochratoxin A，OTA)，該毒素一旦進(jìn)入人體，將嚴(yán)重危害人體健康和生命。赭曲霉毒素A可嚴(yán)重?fù)p害人的肝腎[5]，致畸致癌，并且可經(jīng)血液轉(zhuǎn)入母乳，直接危害嬰兒生命健康[6-7]。OTA分布廣、毒性強(qiáng)，對(duì)狗和豬的口服LD50分別為0.2，1.0 mg/kg[8-9]。OTA因其方便獲得和富集，容易被不法分子利用在飲用水供應(yīng)系統(tǒng)中人為投毒，有可能導(dǎo)致大面積中毒等應(yīng)急事件。

OTA的檢測(cè)方法主要有高效液相質(zhì)譜串聯(lián)法[10]、薄層色譜法[11]、化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法[12]、納米金核酸適配體法[13]、金標(biāo)記羥胺放大化學(xué)發(fā)光法[14]等。這些方法存在設(shè)備維護(hù)昂貴、分析周期長(zhǎng)、前處理繁瑣、納米金檢測(cè)成本高、酶與適配體競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)易受pH、溫度等環(huán)境因素影響及難以對(duì)飲用水中OTA實(shí)現(xiàn)在線監(jiān)測(cè)等缺點(diǎn)。流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法靈敏度高、成本低廉、易操作且可連續(xù)進(jìn)樣實(shí)現(xiàn)快速在線檢測(cè)[15]，已應(yīng)用于食品檢測(cè)[16]、環(huán)境監(jiān)測(cè)[17]和臨床分析[18]等領(lǐng)域。本課題組前期已針對(duì)飲用水中黃綠青霉素[19]、棒曲霉素[20]等毒素開發(fā)了流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光的快速檢測(cè)方法，但由于毒素結(jié)構(gòu)的差異，檢測(cè)的化學(xué)發(fā)光體系也不盡相同。前期預(yù)試驗(yàn)表明，OTA對(duì)魯米諾—高碘酸鈉發(fā)光體系有抑制作用，但信號(hào)很弱，難以檢測(cè)。本研究擬利用光信號(hào)增敏劑，建立流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光新方法用于快速在線監(jiān)測(cè)飲用水中OTA突發(fā)性污染。

1 材料與方法

1.1 主要設(shè)備與試劑

1.1.1 主要儀器設(shè)備

微弱發(fā)光測(cè)量?jī)x：BPCL-K型，北京亞泊斯科技有限公司；

六通轉(zhuǎn)換進(jìn)樣閥：CHEMINERT C22Z-3186型，美國(guó)VICI公司；

蠕動(dòng)泵：BT100-1F型，保定蘭格恒流泵有限公司；

紫外可見分光光度計(jì)：UV-3600 Plus型，日本SHIMADZU公司。

1.1.2 主要試劑

赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品：純度>99.0%，美國(guó)Sigma公司；

魯米諾、吐溫20：分析純，上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 進(jìn)樣方法 如圖1所示，a、b、c、d管路分別泵入魯米諾、樣品、高碘酸鈉和吐溫20溶液，四通道于六通閥混合，混合溶液進(jìn)入化學(xué)發(fā)光流通池中反應(yīng)產(chǎn)生熒光。流通池中的光信號(hào)由光電倍增管PMT放大、檢測(cè)，再轉(zhuǎn)化為電信號(hào)由計(jì)算機(jī)分析和記錄，最終以峰型圖呈現(xiàn)。

a. 魯米諾溶液 b. 樣品溶液 c. 高碘酸鈉溶液 d. 吐溫20溶液 P. 蠕動(dòng)泵 V. 六通轉(zhuǎn)換進(jìn)樣閥 W. 廢液池 F. 化學(xué)發(fā)光流通池 NHV. 負(fù)高壓 PMT. 光電倍增管 PC. 電腦記錄儀

圖1 流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光流程圖

Figure 1 Schematic diagram of flow-injection CL system

1.2.2 化學(xué)發(fā)光動(dòng)力學(xué)特征曲線 以吐溫20為增敏劑，基于OTA對(duì)魯米諾—高碘酸鈉—吐溫20發(fā)光體系的抑制作用，通過(guò)對(duì)比加入吐溫20和OTA體系前后化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的變化，繪制化學(xué)發(fā)光動(dòng)力學(xué)特征曲線。

1.2.3 增敏劑最適濃度選擇 為探究增敏劑吐溫20最適濃度，在氫氧化鈉濃度0.2 mol/L，魯米諾濃濃度6×10-4mol/L，高碘酸鈉濃度5×10-4mol/L，OTA濃度0.006 μg/mL 時(shí)，考察吐溫20濃度(10，20，30，40，50，60，70 mg/L)對(duì)體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響。

1.2.4 單因素試驗(yàn) 為探究反應(yīng)條件中各因素對(duì)體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的作用，單因素試驗(yàn)依次考察氫氧化鈉、魯米諾、高碘酸鈉溶液濃度對(duì)體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響。

(1) 氫氧化鈉濃度選擇：在吐溫20濃度40 mg/L，魯米諾濃度6×10-4mol/L，高碘酸鈉濃度5×10-4mol/L，OTA濃度0.006 μg/mL時(shí)，考察氫氧化鈉濃度(0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35 mol/L)對(duì)體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響。

(2) 魯米諾濃度選擇：在吐溫20濃度40 mg/L，氫氧化鈉濃度0.2 mol/L，高碘酸鈉濃度5×10-4mol/L，OTA濃度0.006 μg/mL時(shí)，考察魯米諾濃度(1×10-4，2×10-4，4×10-4，6×10-4，8×10-4，1×10-3，1.2×10-3mol/L)對(duì)體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響。

(3) 高碘酸鈉濃度選擇：在吐溫20濃度40 mg/L，氫氧化鈉濃度0.2 mol/L，魯米諾濃度6×10-4mol/L，OTA濃度0.006 μg/mL時(shí)，考察高碘酸鈉濃度(5×10-5，1×10-4，3×10-4，5×10-4，7×10-4，9×10-4，1.1×10-3mol/L)對(duì)體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)，采用三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)探討反應(yīng)條件氫氧化鈉濃度、魯米諾濃度、高碘酸鈉濃度之間可能存在的交互作用，并對(duì)試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.6 共存物干擾試驗(yàn) 城市飲用水中常見的無(wú)機(jī)離子和金屬離子等可能會(huì)對(duì)OTA的測(cè)定有一定干擾作用，在最佳試驗(yàn)條件下，OTA濃度0.006 μg/mL，允許干擾誤差±5%時(shí)，考察可能的共存物和常見離子對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。

1.2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測(cè)限、精密度及加標(biāo)回收測(cè)定 在最優(yōu)試驗(yàn)條件下，考察OTA濃度為0.006～1.000 μg/mL時(shí)體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的變化，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算檢測(cè)限和精密度。分別測(cè)定宿舍飲用水、怡寶水、鼎湖山泉水中OTA的含量，并以0.05，0.50 μg/mL OTA進(jìn)行加標(biāo)回收測(cè)定。

1.2.8 反應(yīng)機(jī)理探討 紫外可見分光光度計(jì)分別對(duì)吐溫20溶液、OTA溶液、魯米諾—高碘酸鈉溶液、魯米諾—高碘酸鈉—吐溫20溶液、魯米諾—高碘酸鈉—吐溫20—OTA混合溶液在200～500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外吸收光譜掃描。

2 結(jié)果與分析

2.1 化學(xué)發(fā)光動(dòng)力學(xué)特征曲線

如圖2所示，對(duì)比曲線a、c，說(shuō)明吐溫20可作為敏化劑，使魯米諾—高碘酸鈉發(fā)光體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度顯著增加。分析曲線b、c，說(shuō)明OTA對(duì)魯米諾—高碘酸鈉—吐溫20發(fā)光體系有抑制作用，因此選擇該發(fā)光體系對(duì)OTA進(jìn)行快速檢測(cè)。

2.2 增敏劑最適濃度選擇

隨著吐溫20濃度的增加，體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)(圖3)。當(dāng)吐溫20濃度為40 mg/L時(shí)，體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度較大，此時(shí)峰形很好，基線穩(wěn)定，當(dāng)吐溫20濃度繼續(xù)增大時(shí)，峰形的穩(wěn)定性變差，基線有一定的波動(dòng)，綜合考慮最佳信噪比、試劑消耗、峰形及平臺(tái)區(qū)的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性等因素，選擇最佳吐溫20濃度為40 mg/L。

圖2 化學(xué)發(fā)光體系動(dòng)力學(xué)特征曲線Figure 2 Kinetic characteristics curve for CL system

圖3 吐溫20濃度對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響Figure 3 The effect of Tween 20 concentration on chemiluminescence intensity

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 氫氧化鈉濃度 氫氧化鈉濃度會(huì)直接影響魯米諾的氧化光反應(yīng)。如圖4所示，當(dāng)氫氧化鈉濃度為0.20 mol/L 時(shí)，體系的發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到最大且較穩(wěn)定，過(guò)高的氫氧化鈉濃度反而會(huì)抑制發(fā)光強(qiáng)度，可能堿性過(guò)強(qiáng)會(huì)影響氧化劑的電極電位和氧化能力[21]，從而降低發(fā)光強(qiáng)度，因此選取氫氧化鈉濃度0.20 mol/L。

2.3.2 魯米諾濃度 魯米諾作為發(fā)光劑會(huì)直接影響體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。如圖5所示，體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨魯米諾濃度的增加而增強(qiáng)，而魯米諾濃度高于6×10-4mol/L 時(shí)，體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度增長(zhǎng)較為緩慢，考慮試劑的消耗和環(huán)保等因素，最終選取魯米諾的濃度為6×10-4mol/L。

2.3.3 高碘酸鈉濃度 高碘酸鈉作為發(fā)光體系的氧化劑，其濃度的高低會(huì)顯著影響體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。由圖6可知，體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度先隨高碘酸鈉濃度的增大而增強(qiáng)，當(dāng)高碘酸鈉濃度為5×10-4mol/L時(shí)體系的發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到最大，隨著濃度繼續(xù)增大，體系發(fā)光強(qiáng)度反而緩慢降低，因此選取高碘酸鈉濃度為5×10-4mol/L。

圖4 氫氧化鈉的濃度對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響Figure 4 The effect of sodium hydroxide concentration on chemiluminescence intensity

圖5 魯米諾濃度對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響Figure 5 The effect of luminol concentration on chemiluminescence intensity

圖6 高碘酸鈉濃度對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響Figure 6 The effect of sodium periodate concentration on chemiluminescence intensity

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果 綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，在最佳增敏劑濃度時(shí)，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，以體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)了三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。因素和水平見表1，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2，響應(yīng)面回歸模型方差分析結(jié)果見表3。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Response surface experimental factors and levels mol/L

表2 Box-Behnken試驗(yàn)方案和結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and experimental results

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析?Table 3 Analysis for response surface regression model

? *表示差異顯著，P<0.05；**表示差異極顯著，P<0.01。

2.4.2 模型擬合和顯著性檢驗(yàn) 各因素經(jīng)回歸擬合后，體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度對(duì)氫氧化鈉濃度、魯米諾濃度、高碘酸鈉濃度的多元二次回歸擬合方程如下：

Y=42 553.00+6 267.75A+2 423.25B+928.50C+1 950.50AB+148.50AC-126.00BC-15 830.50A2-8 240.00B2-5 731.50C2。

(1)

由表3可知，模型顯著水平P值<0.000 1，說(shuō)明模型的擬合效果很好，可準(zhǔn)確描述各變量與響應(yīng)值之間的關(guān)系。模型決定系數(shù)R2=0.997 0，表明預(yù)測(cè)結(jié)果和響應(yīng)值結(jié)果有很好的一致性，模型校正系數(shù)RAd j=0.993 0，表示試驗(yàn)結(jié)果有99.30%受試驗(yàn)各變量的影響，說(shuō)明該模型可用于分析和預(yù)測(cè)響應(yīng)值結(jié)果。比較各變量對(duì)響應(yīng)值的影響可知，C項(xiàng)為顯著水平，A、B、A2、B2、C2和AB交互項(xiàng)均為極顯著水平，說(shuō)明回歸模型中各因素不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，存在一定的交互作用，其交互作用通過(guò)3D圖和二維等高線圖可直觀看出，如圖7 所示。

2.4.3 響應(yīng)面最優(yōu)條件預(yù)測(cè)和驗(yàn)證 結(jié)合響應(yīng)面模型優(yōu)化和分析預(yù)測(cè)功能，得到體系檢測(cè)最佳條件為：吐溫20濃度40 mg/L、氫氧化鈉濃度0.21 mol/L、魯米諾濃度6.34×10-4mol/L、高碘酸鈉濃度5.16×10-4mol/L，此時(shí)體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度為43 453?？紤]實(shí)際操作的方便，將最佳檢測(cè)條件修正為：吐溫20濃度40 mg/L、氫氧化鈉濃度0.20 mol/L、魯米諾濃度6.0×10-4mol/L、高碘酸鈉濃度5.0×10-4mol/L。在此條件下進(jìn)行3次平行測(cè)定，實(shí)際體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度為42 596，與預(yù)測(cè)值偏差1.97%，說(shuō)明響應(yīng)面優(yōu)化條件真實(shí)可靠。

2.5 共存物干擾試驗(yàn)

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測(cè)限、精密度及加標(biāo)回收測(cè)定

在最佳條件下，對(duì)不同濃度的OTA進(jìn)行梯度試驗(yàn)，試驗(yàn)表明，體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度(y)與OTA濃度(x)在0.006～1.000 μg/mL 時(shí)有良好的線性關(guān)系，線性方程為y=-3 101.5x+42 120，相關(guān)系數(shù)R2=0.993 1。對(duì)濃度0.2 μg/mL OTA平行測(cè)定11次，計(jì)算得到相對(duì)偏差為1.68%，說(shuō)明儀器精密度良好。按照IUPAC組織的規(guī)定，以3倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算方法的檢測(cè)限為1.74×10-3μg/mL。在最優(yōu)檢測(cè)條件下，分別對(duì)宿舍飲用水、怡寶水、鼎湖山泉水進(jìn)行加標(biāo)回收測(cè)定，結(jié)果見表4，經(jīng)計(jì)算加標(biāo)回收率為80.6%～92.4%。

2.7 反應(yīng)機(jī)理探討

表4 不同水樣中赭曲霉毒素A的加標(biāo)回收測(cè)定結(jié)果Table 4 Obtained results for the determination of OTA in water samples(n=3)

圖7 三因素交互作用的3D圖和等高線圖Figure 7 Three dimensional response surface and contour plots for the interaction of three factors

圖8 紫外—可見吸收光譜圖Figure 8 UV-Vis absorption spectrum of CL system

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光快速在線監(jiān)測(cè)飲用水中OTA的新方法，方法的線性范圍為0.006～1.000 μg/mL，檢出限為1.74×10-3μg/mL(S/N=3)，加標(biāo)回收率為80.6%～92.4%。本法成本低、靈敏度高、可實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)，適用于飲用水中OTA突發(fā)性污染的快速應(yīng)急預(yù)警。但目前的研究主要針對(duì)單一毒素，對(duì)于混合毒素可考慮化學(xué)發(fā)光儀等設(shè)備的串聯(lián)進(jìn)行多毒素的同時(shí)在線監(jiān)測(cè)，并結(jié)合核磁共振、液相質(zhì)譜等方法對(duì)毒素的結(jié)構(gòu)作更深入分析。