丁香酚麻醉斑點(diǎn)叉尾鮰在不同無(wú)水?；顪囟认碌纳砩兓?/h1>
2019-04-01 05:30:28，，，，，
漁業(yè)現(xiàn)代化 2019年1期
，， ， ， ，
(1 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北省農(nóng)產(chǎn)品輻照工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430064；2 四川省原子能研究院輻照保藏四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610101)
斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)，叉尾鮰屬，是一種溫水性淡水魚類，其肉質(zhì)鮮美、易養(yǎng)殖、抗病能力強(qiáng)，是中國(guó)淡水養(yǎng)殖和出口的重要品種之一，擁有廣闊的國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)，2016年全國(guó)總產(chǎn)量達(dá)28.58萬(wàn)t，并逐年穩(wěn)步上升[1]。中國(guó)90%以上的水產(chǎn)品以鮮銷為主，通常由于養(yǎng)殖區(qū)域與銷售市場(chǎng)距離遙遠(yuǎn)，?；钸\(yùn)輸成為水產(chǎn)品鮮銷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]。傳統(tǒng)活魚運(yùn)輸技術(shù)成本高、魚體死亡率大、水處理困難[3]。隨著消費(fèi)者對(duì)水產(chǎn)品鮮活度的要求越來越高，開發(fā)新的水產(chǎn)品保活運(yùn)輸方法， 確保水產(chǎn)品在運(yùn)輸和銷售過程中的?；?、食用安全，已成為亟待解決的問題[4]。
無(wú)水?；钍且环N新型的活魚運(yùn)輸方法，具有活魚運(yùn)載量大、低污染、低成本、低損耗、質(zhì)量高的特點(diǎn)，在水產(chǎn)品保活運(yùn)輸中得到越來越多的關(guān)注[5-6]。魚類運(yùn)輸常使用麻醉劑降低魚類應(yīng)激反應(yīng)，減少對(duì)魚的損傷而提高運(yùn)輸質(zhì)量。丁香酚是一種高效安全、殘留期短的麻醉劑，澳大利亞、智利、芬蘭、新西蘭等多國(guó)認(rèn)為其是合法的水產(chǎn)麻醉劑[4]。丁香酚作為麻醉劑長(zhǎng)距離保活運(yùn)輸單色鯛，可以降低其代謝率，減少氨氮排放量[7]；經(jīng)丁香酚麻醉的美洲鰣幼魚運(yùn)輸應(yīng)激反應(yīng)明顯低于對(duì)照組[8]；丁香酚還可以顯著緩解海葵魚和雙帶雙鋸魚的運(yùn)輸應(yīng)激[9]。斑點(diǎn)叉尾鮰在離水或受應(yīng)激的狀態(tài)下，硬鰭會(huì)豎起，對(duì)其他魚體及其自身都會(huì)造成傷害，其無(wú)水?；钸^程對(duì)麻醉及環(huán)境溫度有較高要求，而丁香酚麻醉斑點(diǎn)叉尾鮰的無(wú)水保活運(yùn)輸目前鮮有報(bào)道。
本文研究了在無(wú)水保活過程中，不同保活溫度對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰的?；顣r(shí)間、存活率和血液生理生化和魚肉品質(zhì)指標(biāo)的影響；通過對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰機(jī)體生理生化指標(biāo)的分析，探索其最佳無(wú)水?；罟に嚰夹g(shù)，從而確定最適宜無(wú)水?；顥l件，明確使用丁香酚對(duì)魚肉營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響，為實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料與設(shè)備
中小型斑點(diǎn)叉尾鮰為試驗(yàn)對(duì)象，購(gòu)自嘉魚三湖漁業(yè)有限責(zé)任公司，選取的魚大小規(guī)格相近，體格健康，平均體質(zhì)量(526.23±10.56)g，體長(zhǎng)(28.3±3.2)cm。
丁香酚(≥98%)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；硼酸、硫酸、氫氧化鈉、鹽酸等試劑均為分析純，購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒(100管/96樣)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑盒(100管/96樣)、尿素氮試劑盒(100管/50樣)、肌酐試劑盒(100管/50樣)均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，在酶標(biāo)儀及紫外可見分光光度計(jì)上進(jìn)行檢測(cè)。
Sigma 3k15高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma 公司)；FD5-Serious真空冷凍干燥機(jī)(GOLD SIM 儀器公司)；LRH-250CL低溫生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器公司)；TA XT Plus質(zhì)構(gòu)儀(英國(guó)SMSTA公司)； HITACH UH5300紫外可見光光度計(jì)(日本日立公司)；TECAN SPARK酶標(biāo)儀(瑞士TECAN儀器公司)；K9860全自動(dòng)凱氏定氮儀(濟(jì)南海能儀器公司)。
1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)
將斑點(diǎn)叉尾鮰置于充分曝氣的自來水中暫養(yǎng)2 d，水溫(18±0.5) ℃，pH(7.6±0.5)，暫養(yǎng)期間停食。本試驗(yàn)對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰無(wú)水?；疃掏具\(yùn)輸條件進(jìn)行研究，設(shè)定?；顣r(shí)間5 h。配置丁香酚溶液質(zhì)量濃度為60 mg/L，將禁食暫養(yǎng)的斑點(diǎn)叉尾鮰浸浴在丁香酚溶液中麻醉，觀察不同階段試驗(yàn)魚(指代斑點(diǎn)叉尾鮰，下文同)的狀態(tài)。麻醉10 min后待試驗(yàn)魚基本進(jìn)入深度麻醉狀態(tài)，將其裝入塑料袋中，充入純氧后密封，置于生化培養(yǎng)箱中于不同溫度下模擬無(wú)水?；钸\(yùn)輸。?；? h后，將休眠中的試驗(yàn)魚轉(zhuǎn)移至?xí)吼B(yǎng)水體中復(fù)蘇24 h，觀察其復(fù)蘇狀態(tài)。為研究丁香酚麻醉?；钸^程中各階段斑點(diǎn)叉尾鮰的生理生化指標(biāo)及肌肉營(yíng)養(yǎng)成分變化情況，分別測(cè)定?；钋?對(duì)照組)、保活5 h后、復(fù)蘇24 h后(清水中復(fù)蘇24 h)各指標(biāo)的變化，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15條魚。
1.3 無(wú)水?；钶^佳溫度的確定
丁香酚麻醉斑點(diǎn)叉尾鮰無(wú)水?；? h后，以試驗(yàn)魚存活率為指標(biāo)，研究其無(wú)水保活較佳溫度范圍。調(diào)節(jié)生化培養(yǎng)箱溫度為0 ℃、2 ℃、4 ℃、6 ℃、8 ℃，每隔30 min觀察試驗(yàn)魚生存狀態(tài)。若在麻醉≤5 h魚就蘇醒，則直接置于清水中，停止觀察。?；? h后，如果魚鰓無(wú)明顯張合，刺激無(wú)反應(yīng)，將魚置于暫養(yǎng)清水中復(fù)蘇，記錄復(fù)蘇24 h后存活魚的數(shù)量。存活率計(jì)算公式：
S= 100%×A2/A1
(1)
式中：S—存活率；A1—初始魚條數(shù)；A2—清水復(fù)蘇24 h后存活魚條數(shù)。
1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法
1.4.1 血液指標(biāo)的測(cè)定
取血方法 每組魚采用尾部靜脈取血，注入10 mL離心管中，每毫升血液用20U肝素抗凝[10]，在4 ℃下靜置3 h后，3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上層血漿于-20 ℃冰箱中備用[11]。
血液指標(biāo)測(cè)定方法 谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)采用紫外-賴氏法測(cè)定，肌酐(CREA)采用紫外-苦味酸法測(cè)定，尿素氮(BUN)含量采用紫外-脲酶法測(cè)定。以上指標(biāo)均用南京建成生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定[12-13]。
1.4.2 肌肉指標(biāo)的測(cè)定
肌肉取樣 每組魚取血后，取其背部肌肉，一部分留待質(zhì)構(gòu)測(cè)量，一部分用高速絞肉機(jī)攪碎并混勻，真空冷凍干燥后粉碎，過40目篩，裝在若干獨(dú)立包裝袋中密封于-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定 蛋白質(zhì)含量采用GB 5009.5—2016[14]中自動(dòng)凱氏定氮儀法進(jìn)行測(cè)定，脂肪含量采用GB 5009.6—2016[15]中索氏抽提法進(jìn)行測(cè)定，凍干肉粉中水解氨基酸含量參照GB 5009.124—2016[16]中食品中氨基酸的測(cè)定法，用氨基酸分析儀(茚三酮柱后衍生離子交換色譜儀)測(cè)定。
質(zhì)構(gòu)測(cè)定 采用TA XT Plus質(zhì)構(gòu)儀來測(cè)定魚肉彈性、硬度以及咀嚼性。取魚背部肌肉，將魚肉切成20 mm×20 mm×10 mm的方塊，使用平底柱形探頭P/36R，樣品垂直于其厚度方向平放，每次測(cè)1個(gè)樣品，每組樣品測(cè)定8個(gè)平行樣，取平均值。測(cè)試條件：測(cè)試前速率1.0 mm/s，測(cè)試速率1.0 mm/s,測(cè)試后速率3.0 mm/s，壓縮比50%，停留時(shí)間間隔5 s。
1.6 數(shù)據(jù)處理
2 結(jié)果與分析
2.1 無(wú)水?；钶^佳溫度范圍的確定
?；顪囟葘?duì)斑點(diǎn)叉尾鮰?；顣r(shí)間及存活率的影響見表1。由表1可知，在?；顪囟葹? ℃、2 ℃、4 ℃、6 ℃時(shí)，可以達(dá)到無(wú)水?；? h；當(dāng)保活溫度升到8 ℃時(shí)，無(wú)水?；? h后試驗(yàn)魚全部蘇醒，放入清水中，停止觀察，該組終止試驗(yàn)。當(dāng)保活溫度較低(0 ℃)時(shí)，保活5 h后在清水中復(fù)蘇24 h，試驗(yàn)魚存活率只有60%；保活溫度為2 ℃、4 ℃、6 ℃時(shí)，置于清水中復(fù)蘇24 h后，存活率可以≥80%。結(jié)果表明，2 ℃～6 ℃下?；?，?；钚Ч^好，完全滿足?；? h且存活率≥80%的要求。當(dāng)保活溫度較低時(shí)，水溫從18 ℃降至較低溫度，溫差大，短時(shí)間內(nèi)溫度變化大，對(duì)魚體造成強(qiáng)烈瞬間應(yīng)激，造成魚體損傷，故在較低溫度下(0 ℃)保活5 h后，試驗(yàn)魚存活率較低。而溫度較高時(shí)，無(wú)水?；钸^程中周圍環(huán)境溫度較高，魚體新陳代謝速率較快，且丁香酚屬于較易揮發(fā)的麻醉劑，高溫加快了丁香酚在魚體內(nèi)的循環(huán)代謝速率，使麻醉劑被很快排出體外，失去麻醉效果，?；顣r(shí)間顯著縮短[6]。
表1 不同?；顪囟葘?duì)斑點(diǎn)叉尾鮰?；顣r(shí)間和存活率的影響
2.2 丁香酚麻醉?；顚?duì)斑點(diǎn)叉尾鮰血液生化指標(biāo)的影響
2.2.1 對(duì)谷丙轉(zhuǎn)氨酶的影響
若魚體肝臟受損，則肝臟中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)會(huì)釋放到血液中，ALT顯著性上升[4,17]。如圖1，血液ALT活性在?；? h后都顯著上升(P<0.05)。在0 ℃下，ALT增量最大(105.4%)；2 ℃下增量最小(47.82%)。在清水中復(fù)蘇24 h后，0 ℃和2 ℃?；罱M恢復(fù)至21.53和12.52 U/L，而4 ℃和6 ℃下仍較高。說明在較高溫度下保活，肝臟發(fā)生不可逆損傷，而低溫下的恢復(fù)性較好。這可能是由于在丁香酚麻醉斑點(diǎn)叉尾鮰無(wú)水?；钸^程中，試驗(yàn)魚在?；顪囟容^高時(shí)，麻醉不完全，魚較易蘇醒，代謝較強(qiáng)，肝臟受損嚴(yán)重，ALT含量顯著上升，且較難恢復(fù)。聶小寶等[18]研究不同溫度下無(wú)水?；铟\魚，在2 ℃無(wú)水?；瞽h(huán)境下保存效果最佳，對(duì)肝臟損傷最小。
圖1 不同溫度條件下血液谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性變化
2.2.2 對(duì)谷草轉(zhuǎn)氨酶的影響
谷草轉(zhuǎn)氨酶活性可以反映魚體心肌細(xì)胞及肝臟受損和代謝程度，是機(jī)體組織細(xì)胞膜完整性的一個(gè)重要標(biāo)志[19-20]。由圖2可知，麻醉保活后，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性升高，且?；顪囟仍礁?，AST升高越明顯，6 ℃組AST增加了44.91 U/L。在清水中復(fù)蘇24 h后，2 ℃組完全恢復(fù)到16.13 U/L，4 ℃、6 ℃組有一定程度的恢復(fù)，但0 ℃組持續(xù)增加至57.91 U/L。
圖2 不同溫度條件下血液谷草轉(zhuǎn)氨酶活性變化
在丁香酚麻醉?；钸^程中，?；顪囟仍礁撸珹ST活性越大，這可能是由于在較高溫下麻醉應(yīng)激及代謝程度較高，對(duì)心肌損傷較大，但隨著在清水中的復(fù)蘇，損傷得到一定程度的恢復(fù)。?；顪囟忍?0 ℃)，低溫應(yīng)激對(duì)魚體造成不可逆的損傷，很難恢復(fù)。這可能是由于長(zhǎng)時(shí)間低溫?zé)o水環(huán)境使魚心肌收縮力加強(qiáng)，心肌細(xì)胞代謝加快，負(fù)荷超重，受損嚴(yán)重[21-22]。研究發(fā)現(xiàn)，鯽魚無(wú)水?；钜欢〞r(shí)間后，AST顯著升高，在清水中會(huì)有一定程度復(fù)蘇[23]。
2.2.3 對(duì)肌酐的影響
由圖3可見，?；? h后，肌酐(CREA)含量顯著上升(P<0.05)，尤其在0 ℃、6 ℃下，分別升高了58.51%和100.8%，復(fù)蘇24 h后仍高達(dá)87.67 μmol/L 和97.17 μmol/L； 2 ℃?；罱M，肌酐由保活前的66.57 μmol/L升高到?；詈蟮?0.89 μmol/L，而清水中復(fù)蘇24 h后恢復(fù)至64.35 μmol/L。斑點(diǎn)叉尾鮰在低溫?zé)o水條件下保活，腎功能會(huì)受到一定程度的損傷，腎臟對(duì)肌酐的過濾或排泄功能將弱化，導(dǎo)致肌酐含量顯著升高[24]，這也是長(zhǎng)時(shí)間?；顣?huì)導(dǎo)致魚體死亡的原因之一[25]。溫度是影響其損傷程度的重要因素，較高和較低溫度皆不利于斑點(diǎn)叉尾鮰的無(wú)水?；?。
圖3 不同溫度條件下血液肌酐含量變化
2.2.4 對(duì)尿素氮的影響
尿素(BUN)氮同肌酐類似，是表征腎臟功能的重要指標(biāo)[26]。由圖4可知，麻醉?；? h后，尿素氮含量顯著升高(P<0.05)，升高率達(dá)40.3%～193%，尤其4 ℃和6 ℃組。不同保活溫度下，尿素氮含量差異顯著(P<0.05)，但變化趨勢(shì)相同。結(jié)合肌酐含量變化趨勢(shì)，麻醉無(wú)水?；钸^程會(huì)對(duì)腎臟造成不可逆的損傷，在清水中復(fù)蘇后也很難恢復(fù)。究其原因，在無(wú)水保活過程中，魚體腎功能機(jī)能發(fā)生障礙，腎臟代謝廢物功能受到抑制，血液中代謝產(chǎn)物不能被有效排除到體外，導(dǎo)致尿素氮和氨氮含量升高，引起氨氮中毒，進(jìn)一步加深損害程度，且這一損傷很難通過魚體自身調(diào)節(jié)恢復(fù)，使得整個(gè)?；罴盎謴?fù)過程中尿素氮都呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[27-28]。
圖4 不同溫度條件下血液尿素氮活性變化
2.3 丁香酚麻醉?；顚?duì)斑點(diǎn)叉尾鮰機(jī)體營(yíng)養(yǎng)成分和質(zhì)構(gòu)的影響
由表2可知，經(jīng)過5 h的無(wú)水?；?，總蛋白含量降低率達(dá)0.9%～8.5%，尤其是6 ℃組。粗脂肪含量在無(wú)水?；詈箫@著下降(P<0.05)，6 ℃組下降了18.98%，而 2 ℃組下降幅度只有3.46%。據(jù)推測(cè)，造成魚體蛋白質(zhì)和脂肪等功能物質(zhì)含量降低的原因，是由于魚在無(wú)水?；钸^程中還有一定的能量消耗，在沒有外部能量補(bǔ)充的情況下，蛋白質(zhì)和脂肪作為能源物質(zhì)被消耗。保活溫度較高時(shí)，丁香酚麻醉下的魚體未能進(jìn)入深度麻醉，代謝旺盛，能量消耗加劇，而溫度降低到0 ℃時(shí)，由于保活前(18 ℃)到?；畹牡蜏丨h(huán)境溫差較大，溫度驟降，使魚的應(yīng)激要強(qiáng)于其他組，魚體對(duì)能量的消耗增加，促進(jìn)供能物質(zhì)蛋白質(zhì)減少[22]，而在2 ℃下，溫度造成的能量消耗達(dá)到最低。
食品的質(zhì)構(gòu)特性是體現(xiàn)魚肉質(zhì)量的重要指標(biāo)[29]，可以表征無(wú)水?；钸^程對(duì)魚肉在食用口感特性方面的影響。由表2可知，經(jīng)過5 h無(wú)水保活， 0 ℃保活組，硬度、彈性和咀嚼性分別下降21.4%，38.8%，16.4%，在清水中恢復(fù)24 h后，分別恢復(fù)至?；钋暗?2.4%，58.5%和93.0%。6 ℃?；罱M質(zhì)構(gòu)參數(shù)變化趨勢(shì)最小。究其原因，可能是因?yàn)樵谳^低溫度下魚體肌肉活動(dòng)受限，但維持代謝需要消耗體內(nèi)供能物質(zhì)，肌肉蛋白質(zhì)在不斷被降解，肌肉細(xì)胞間的結(jié)合力在逐漸降低，成分發(fā)生變化，造成硬度、彈性和咀嚼性參數(shù)下降[29]。研究表明，魚類在受到應(yīng)激反應(yīng)時(shí)會(huì)導(dǎo)致肌肉組織的軟化[30]；Hultmann等[31]通過對(duì)鱈魚刺激發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激會(huì)使硬度值顯著減小。
表2 丁香酚麻醉斑點(diǎn)叉尾鮰在不同?；顪囟认卖~肉品質(zhì)的變化
注：A-D表示在同一測(cè)量時(shí)間下數(shù)值差異顯著；a-c表示在同一溫度下數(shù)值差異顯著
2.4 丁香酚麻醉?；顚?duì)斑點(diǎn)叉尾鮰機(jī)體水解氨基酸含量的影響
由表3可知，水解氨基酸總量在無(wú)水?；詈蟮陀诔跏妓剑? ℃?；罱M，人體所需的7種必需氨基酸Lys、Met、Leu、Ile、Thr、Val、Phe值均較?；钋按蠓忍岣撸@示斑點(diǎn)叉尾鮰在2 ℃?；钣休^高的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。
表3 丁香酚麻醉斑點(diǎn)叉尾鮰在不同溫度下無(wú)水保活5 h魚肉中水解氨基酸含量的變化
曾鵬等[32]研究發(fā)現(xiàn)，鯽魚冰溫離水儲(chǔ)藏后，必需氨基酸值大幅提高，多種氨基酸水解含量都高于對(duì)照組鮮魚，有利于營(yíng)養(yǎng)吸收。4 ℃和6 ℃下，各氨基酸成分都有所下降，溫度越高，下降幅度越大。在2 ℃下，各必需氨基酸的增加可能與低溫?；罾溥m應(yīng)后魚體抗凍能力增加，魚體為抵御低溫和重新適應(yīng)正常環(huán)境體內(nèi)正常的代謝活動(dòng)所致[33]。有文獻(xiàn)指出[34]，生活在極地的魚類通過產(chǎn)生抗凍糖肽起到降低冰點(diǎn)抗凍的作用，而4 ℃和6 ℃下無(wú)水?；睿岷拷档?，可能是在此溫度下保活，斑點(diǎn)叉尾鮰代謝率較低溫(0 ℃、2 ℃)要高，食物蛋白質(zhì)經(jīng)過消化吸收獲得氨基酸并參與體內(nèi)代謝，氨基酸為試驗(yàn)魚基礎(chǔ)代謝提供能量物質(zhì)而消耗。據(jù)報(bào)道，支鏈氨基酸可以作為硬骨魚提供能量代謝的物質(zhì)，可為低溫下活魚的代謝提供能量[35]。
3 結(jié)論
丁香酚麻醉斑點(diǎn)叉尾鮰成功無(wú)水?；? h且存活率≥80%的溫度范圍為2 ℃～6 ℃；無(wú)水?；? h后，AST、ALT活性均有顯著升高，而在清水中復(fù)蘇24 h后，2 ℃?；罱M可恢復(fù)至對(duì)照組值；肌酐和尿素氮在?；? h后顯著增加(P<0.05)，對(duì)腎臟造成的不可逆的損傷，在6 ℃下影響最大；蛋白質(zhì)和脂肪等作為能源物質(zhì)被消耗，?；? h后顯著下降(P<0.05)，溫度越高，下降越明顯；質(zhì)構(gòu)指標(biāo)中，硬度、咀嚼性會(huì)顯著下降(P<0.05)，但在清水中復(fù)蘇24 h后顯著上升(P<0.05)，彈性較難恢復(fù)；2 ℃下?；顣r(shí)，8種必需氨基酸含量增加。綜上表明，2 ℃下保活，丁香酚麻醉斑點(diǎn)叉尾鮰無(wú)水保活對(duì)魚肉的生理生化指標(biāo)影響較小，且基本可以恢復(fù)到初始水平，是較適宜的無(wú)水?；顪囟?。該研究結(jié)果揭示了以丁香酚作為麻醉劑，斑點(diǎn)叉尾鮰無(wú)水保活運(yùn)輸過程中不同溫度下的生理生化特點(diǎn)，為進(jìn)一步研究保活過程中斑點(diǎn)叉尾鮰新陳代謝特點(diǎn)提供數(shù)據(jù)支撐和參考。
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(1 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北省農(nóng)產(chǎn)品輻照工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430064；2 四川省原子能研究院輻照保藏四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610101)
斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)，叉尾鮰屬，是一種溫水性淡水魚類，其肉質(zhì)鮮美、易養(yǎng)殖、抗病能力強(qiáng)，是中國(guó)淡水養(yǎng)殖和出口的重要品種之一，擁有廣闊的國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)，2016年全國(guó)總產(chǎn)量達(dá)28.58萬(wàn)t，并逐年穩(wěn)步上升[1]。中國(guó)90%以上的水產(chǎn)品以鮮銷為主，通常由于養(yǎng)殖區(qū)域與銷售市場(chǎng)距離遙遠(yuǎn)，?；钸\(yùn)輸成為水產(chǎn)品鮮銷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]。傳統(tǒng)活魚運(yùn)輸技術(shù)成本高、魚體死亡率大、水處理困難[3]。隨著消費(fèi)者對(duì)水產(chǎn)品鮮活度的要求越來越高，開發(fā)新的水產(chǎn)品保活運(yùn)輸方法， 確保水產(chǎn)品在運(yùn)輸和銷售過程中的?；?、食用安全，已成為亟待解決的問題[4]。
無(wú)水?；钍且环N新型的活魚運(yùn)輸方法，具有活魚運(yùn)載量大、低污染、低成本、低損耗、質(zhì)量高的特點(diǎn)，在水產(chǎn)品保活運(yùn)輸中得到越來越多的關(guān)注[5-6]。魚類運(yùn)輸常使用麻醉劑降低魚類應(yīng)激反應(yīng)，減少對(duì)魚的損傷而提高運(yùn)輸質(zhì)量。丁香酚是一種高效安全、殘留期短的麻醉劑，澳大利亞、智利、芬蘭、新西蘭等多國(guó)認(rèn)為其是合法的水產(chǎn)麻醉劑[4]。丁香酚作為麻醉劑長(zhǎng)距離保活運(yùn)輸單色鯛，可以降低其代謝率，減少氨氮排放量[7]；經(jīng)丁香酚麻醉的美洲鰣幼魚運(yùn)輸應(yīng)激反應(yīng)明顯低于對(duì)照組[8]；丁香酚還可以顯著緩解海葵魚和雙帶雙鋸魚的運(yùn)輸應(yīng)激[9]。斑點(diǎn)叉尾鮰在離水或受應(yīng)激的狀態(tài)下，硬鰭會(huì)豎起，對(duì)其他魚體及其自身都會(huì)造成傷害，其無(wú)水?；钸^程對(duì)麻醉及環(huán)境溫度有較高要求，而丁香酚麻醉斑點(diǎn)叉尾鮰的無(wú)水保活運(yùn)輸目前鮮有報(bào)道。
本文研究了在無(wú)水保活過程中，不同保活溫度對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰的?；顣r(shí)間、存活率和血液生理生化和魚肉品質(zhì)指標(biāo)的影響；通過對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰機(jī)體生理生化指標(biāo)的分析，探索其最佳無(wú)水?；罟に嚰夹g(shù)，從而確定最適宜無(wú)水?；顥l件，明確使用丁香酚對(duì)魚肉營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響，為實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料與設(shè)備
中小型斑點(diǎn)叉尾鮰為試驗(yàn)對(duì)象，購(gòu)自嘉魚三湖漁業(yè)有限責(zé)任公司，選取的魚大小規(guī)格相近，體格健康，平均體質(zhì)量(526.23±10.56)g，體長(zhǎng)(28.3±3.2)cm。
丁香酚(≥98%)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；硼酸、硫酸、氫氧化鈉、鹽酸等試劑均為分析純，購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒(100管/96樣)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑盒(100管/96樣)、尿素氮試劑盒(100管/50樣)、肌酐試劑盒(100管/50樣)均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，在酶標(biāo)儀及紫外可見分光光度計(jì)上進(jìn)行檢測(cè)。
Sigma 3k15高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma 公司)；FD5-Serious真空冷凍干燥機(jī)(GOLD SIM 儀器公司)；LRH-250CL低溫生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器公司)；TA XT Plus質(zhì)構(gòu)儀(英國(guó)SMSTA公司)； HITACH UH5300紫外可見光光度計(jì)(日本日立公司)；TECAN SPARK酶標(biāo)儀(瑞士TECAN儀器公司)；K9860全自動(dòng)凱氏定氮儀(濟(jì)南海能儀器公司)。
1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)
將斑點(diǎn)叉尾鮰置于充分曝氣的自來水中暫養(yǎng)2 d，水溫(18±0.5) ℃，pH(7.6±0.5)，暫養(yǎng)期間停食。本試驗(yàn)對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰無(wú)水?；疃掏具\(yùn)輸條件進(jìn)行研究，設(shè)定?；顣r(shí)間5 h。配置丁香酚溶液質(zhì)量濃度為60 mg/L，將禁食暫養(yǎng)的斑點(diǎn)叉尾鮰浸浴在丁香酚溶液中麻醉，觀察不同階段試驗(yàn)魚(指代斑點(diǎn)叉尾鮰，下文同)的狀態(tài)。麻醉10 min后待試驗(yàn)魚基本進(jìn)入深度麻醉狀態(tài)，將其裝入塑料袋中，充入純氧后密封，置于生化培養(yǎng)箱中于不同溫度下模擬無(wú)水?；钸\(yùn)輸。?；? h后，將休眠中的試驗(yàn)魚轉(zhuǎn)移至?xí)吼B(yǎng)水體中復(fù)蘇24 h，觀察其復(fù)蘇狀態(tài)。為研究丁香酚麻醉?；钸^程中各階段斑點(diǎn)叉尾鮰的生理生化指標(biāo)及肌肉營(yíng)養(yǎng)成分變化情況，分別測(cè)定?；钋?對(duì)照組)、保活5 h后、復(fù)蘇24 h后(清水中復(fù)蘇24 h)各指標(biāo)的變化，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15條魚。
1.3 無(wú)水?；钶^佳溫度的確定
丁香酚麻醉斑點(diǎn)叉尾鮰無(wú)水?；? h后，以試驗(yàn)魚存活率為指標(biāo)，研究其無(wú)水保活較佳溫度范圍。調(diào)節(jié)生化培養(yǎng)箱溫度為0 ℃、2 ℃、4 ℃、6 ℃、8 ℃，每隔30 min觀察試驗(yàn)魚生存狀態(tài)。若在麻醉≤5 h魚就蘇醒，則直接置于清水中，停止觀察。?；? h后，如果魚鰓無(wú)明顯張合，刺激無(wú)反應(yīng)，將魚置于暫養(yǎng)清水中復(fù)蘇，記錄復(fù)蘇24 h后存活魚的數(shù)量。存活率計(jì)算公式：
S= 100%×A2/A1
(1)
式中：S—存活率；A1—初始魚條數(shù)；A2—清水復(fù)蘇24 h后存活魚條數(shù)。
1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法
1.4.1 血液指標(biāo)的測(cè)定
取血方法 每組魚采用尾部靜脈取血，注入10 mL離心管中，每毫升血液用20U肝素抗凝[10]，在4 ℃下靜置3 h后，3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上層血漿于-20 ℃冰箱中備用[11]。
血液指標(biāo)測(cè)定方法 谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)采用紫外-賴氏法測(cè)定，肌酐(CREA)采用紫外-苦味酸法測(cè)定，尿素氮(BUN)含量采用紫外-脲酶法測(cè)定。以上指標(biāo)均用南京建成生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定[12-13]。
1.4.2 肌肉指標(biāo)的測(cè)定
肌肉取樣 每組魚取血后，取其背部肌肉，一部分留待質(zhì)構(gòu)測(cè)量，一部分用高速絞肉機(jī)攪碎并混勻，真空冷凍干燥后粉碎，過40目篩，裝在若干獨(dú)立包裝袋中密封于-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定 蛋白質(zhì)含量采用GB 5009.5—2016[14]中自動(dòng)凱氏定氮儀法進(jìn)行測(cè)定，脂肪含量采用GB 5009.6—2016[15]中索氏抽提法進(jìn)行測(cè)定，凍干肉粉中水解氨基酸含量參照GB 5009.124—2016[16]中食品中氨基酸的測(cè)定法，用氨基酸分析儀(茚三酮柱后衍生離子交換色譜儀)測(cè)定。
質(zhì)構(gòu)測(cè)定 采用TA XT Plus質(zhì)構(gòu)儀來測(cè)定魚肉彈性、硬度以及咀嚼性。取魚背部肌肉，將魚肉切成20 mm×20 mm×10 mm的方塊，使用平底柱形探頭P/36R，樣品垂直于其厚度方向平放，每次測(cè)1個(gè)樣品，每組樣品測(cè)定8個(gè)平行樣，取平均值。測(cè)試條件：測(cè)試前速率1.0 mm/s，測(cè)試速率1.0 mm/s,測(cè)試后速率3.0 mm/s，壓縮比50%，停留時(shí)間間隔5 s。
1.6 數(shù)據(jù)處理
2 結(jié)果與分析
2.1 無(wú)水?；钶^佳溫度范圍的確定
?；顪囟葘?duì)斑點(diǎn)叉尾鮰?；顣r(shí)間及存活率的影響見表1。由表1可知，在?；顪囟葹? ℃、2 ℃、4 ℃、6 ℃時(shí)，可以達(dá)到無(wú)水?；? h；當(dāng)保活溫度升到8 ℃時(shí)，無(wú)水?；? h后試驗(yàn)魚全部蘇醒，放入清水中，停止觀察，該組終止試驗(yàn)。當(dāng)保活溫度較低(0 ℃)時(shí)，保活5 h后在清水中復(fù)蘇24 h，試驗(yàn)魚存活率只有60%；保活溫度為2 ℃、4 ℃、6 ℃時(shí)，置于清水中復(fù)蘇24 h后，存活率可以≥80%。結(jié)果表明，2 ℃～6 ℃下?；?，?；钚Ч^好，完全滿足?；? h且存活率≥80%的要求。當(dāng)保活溫度較低時(shí)，水溫從18 ℃降至較低溫度，溫差大，短時(shí)間內(nèi)溫度變化大，對(duì)魚體造成強(qiáng)烈瞬間應(yīng)激，造成魚體損傷，故在較低溫度下(0 ℃)保活5 h后，試驗(yàn)魚存活率較低。而溫度較高時(shí)，無(wú)水?；钸^程中周圍環(huán)境溫度較高，魚體新陳代謝速率較快，且丁香酚屬于較易揮發(fā)的麻醉劑，高溫加快了丁香酚在魚體內(nèi)的循環(huán)代謝速率，使麻醉劑被很快排出體外，失去麻醉效果，?；顣r(shí)間顯著縮短[6]。
表1 不同?；顪囟葘?duì)斑點(diǎn)叉尾鮰?；顣r(shí)間和存活率的影響
2.2 丁香酚麻醉?；顚?duì)斑點(diǎn)叉尾鮰血液生化指標(biāo)的影響
2.2.1 對(duì)谷丙轉(zhuǎn)氨酶的影響
若魚體肝臟受損，則肝臟中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)會(huì)釋放到血液中，ALT顯著性上升[4,17]。如圖1，血液ALT活性在?；? h后都顯著上升(P<0.05)。在0 ℃下，ALT增量最大(105.4%)；2 ℃下增量最小(47.82%)。在清水中復(fù)蘇24 h后，0 ℃和2 ℃?；罱M恢復(fù)至21.53和12.52 U/L，而4 ℃和6 ℃下仍較高。說明在較高溫度下保活，肝臟發(fā)生不可逆損傷，而低溫下的恢復(fù)性較好。這可能是由于在丁香酚麻醉斑點(diǎn)叉尾鮰無(wú)水?；钸^程中，試驗(yàn)魚在?；顪囟容^高時(shí)，麻醉不完全，魚較易蘇醒，代謝較強(qiáng)，肝臟受損嚴(yán)重，ALT含量顯著上升，且較難恢復(fù)。聶小寶等[18]研究不同溫度下無(wú)水?；铟\魚，在2 ℃無(wú)水?；瞽h(huán)境下保存效果最佳，對(duì)肝臟損傷最小。
圖1 不同溫度條件下血液谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性變化
2.2.2 對(duì)谷草轉(zhuǎn)氨酶的影響
谷草轉(zhuǎn)氨酶活性可以反映魚體心肌細(xì)胞及肝臟受損和代謝程度，是機(jī)體組織細(xì)胞膜完整性的一個(gè)重要標(biāo)志[19-20]。由圖2可知，麻醉保活后，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性升高，且?；顪囟仍礁?，AST升高越明顯，6 ℃組AST增加了44.91 U/L。在清水中復(fù)蘇24 h后，2 ℃組完全恢復(fù)到16.13 U/L，4 ℃、6 ℃組有一定程度的恢復(fù)，但0 ℃組持續(xù)增加至57.91 U/L。
圖2 不同溫度條件下血液谷草轉(zhuǎn)氨酶活性變化
在丁香酚麻醉?；钸^程中，?；顪囟仍礁撸珹ST活性越大，這可能是由于在較高溫下麻醉應(yīng)激及代謝程度較高，對(duì)心肌損傷較大，但隨著在清水中的復(fù)蘇，損傷得到一定程度的恢復(fù)。?；顪囟忍?0 ℃)，低溫應(yīng)激對(duì)魚體造成不可逆的損傷，很難恢復(fù)。這可能是由于長(zhǎng)時(shí)間低溫?zé)o水環(huán)境使魚心肌收縮力加強(qiáng)，心肌細(xì)胞代謝加快，負(fù)荷超重，受損嚴(yán)重[21-22]。研究發(fā)現(xiàn)，鯽魚無(wú)水?；钜欢〞r(shí)間后，AST顯著升高，在清水中會(huì)有一定程度復(fù)蘇[23]。
2.2.3 對(duì)肌酐的影響
由圖3可見，?；? h后，肌酐(CREA)含量顯著上升(P<0.05)，尤其在0 ℃、6 ℃下，分別升高了58.51%和100.8%，復(fù)蘇24 h后仍高達(dá)87.67 μmol/L 和97.17 μmol/L； 2 ℃?；罱M，肌酐由保活前的66.57 μmol/L升高到?；詈蟮?0.89 μmol/L，而清水中復(fù)蘇24 h后恢復(fù)至64.35 μmol/L。斑點(diǎn)叉尾鮰在低溫?zé)o水條件下保活，腎功能會(huì)受到一定程度的損傷，腎臟對(duì)肌酐的過濾或排泄功能將弱化，導(dǎo)致肌酐含量顯著升高[24]，這也是長(zhǎng)時(shí)間?；顣?huì)導(dǎo)致魚體死亡的原因之一[25]。溫度是影響其損傷程度的重要因素，較高和較低溫度皆不利于斑點(diǎn)叉尾鮰的無(wú)水?；?。
圖3 不同溫度條件下血液肌酐含量變化
2.2.4 對(duì)尿素氮的影響
尿素(BUN)氮同肌酐類似，是表征腎臟功能的重要指標(biāo)[26]。由圖4可知，麻醉?；? h后，尿素氮含量顯著升高(P<0.05)，升高率達(dá)40.3%～193%，尤其4 ℃和6 ℃組。不同保活溫度下，尿素氮含量差異顯著(P<0.05)，但變化趨勢(shì)相同。結(jié)合肌酐含量變化趨勢(shì)，麻醉無(wú)水?；钸^程會(huì)對(duì)腎臟造成不可逆的損傷，在清水中復(fù)蘇后也很難恢復(fù)。究其原因，在無(wú)水保活過程中，魚體腎功能機(jī)能發(fā)生障礙，腎臟代謝廢物功能受到抑制，血液中代謝產(chǎn)物不能被有效排除到體外，導(dǎo)致尿素氮和氨氮含量升高，引起氨氮中毒，進(jìn)一步加深損害程度，且這一損傷很難通過魚體自身調(diào)節(jié)恢復(fù)，使得整個(gè)?；罴盎謴?fù)過程中尿素氮都呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[27-28]。
圖4 不同溫度條件下血液尿素氮活性變化
2.3 丁香酚麻醉?；顚?duì)斑點(diǎn)叉尾鮰機(jī)體營(yíng)養(yǎng)成分和質(zhì)構(gòu)的影響
由表2可知，經(jīng)過5 h的無(wú)水?；?，總蛋白含量降低率達(dá)0.9%～8.5%，尤其是6 ℃組。粗脂肪含量在無(wú)水?；詈箫@著下降(P<0.05)，6 ℃組下降了18.98%，而 2 ℃組下降幅度只有3.46%。據(jù)推測(cè)，造成魚體蛋白質(zhì)和脂肪等功能物質(zhì)含量降低的原因，是由于魚在無(wú)水?；钸^程中還有一定的能量消耗，在沒有外部能量補(bǔ)充的情況下，蛋白質(zhì)和脂肪作為能源物質(zhì)被消耗。保活溫度較高時(shí)，丁香酚麻醉下的魚體未能進(jìn)入深度麻醉，代謝旺盛，能量消耗加劇，而溫度降低到0 ℃時(shí)，由于保活前(18 ℃)到?；畹牡蜏丨h(huán)境溫差較大，溫度驟降，使魚的應(yīng)激要強(qiáng)于其他組，魚體對(duì)能量的消耗增加，促進(jìn)供能物質(zhì)蛋白質(zhì)減少[22]，而在2 ℃下，溫度造成的能量消耗達(dá)到最低。
食品的質(zhì)構(gòu)特性是體現(xiàn)魚肉質(zhì)量的重要指標(biāo)[29]，可以表征無(wú)水?；钸^程對(duì)魚肉在食用口感特性方面的影響。由表2可知，經(jīng)過5 h無(wú)水保活， 0 ℃保活組，硬度、彈性和咀嚼性分別下降21.4%，38.8%，16.4%，在清水中恢復(fù)24 h后，分別恢復(fù)至?；钋暗?2.4%，58.5%和93.0%。6 ℃?；罱M質(zhì)構(gòu)參數(shù)變化趨勢(shì)最小。究其原因，可能是因?yàn)樵谳^低溫度下魚體肌肉活動(dòng)受限，但維持代謝需要消耗體內(nèi)供能物質(zhì)，肌肉蛋白質(zhì)在不斷被降解，肌肉細(xì)胞間的結(jié)合力在逐漸降低，成分發(fā)生變化，造成硬度、彈性和咀嚼性參數(shù)下降[29]。研究表明，魚類在受到應(yīng)激反應(yīng)時(shí)會(huì)導(dǎo)致肌肉組織的軟化[30]；Hultmann等[31]通過對(duì)鱈魚刺激發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激會(huì)使硬度值顯著減小。
表2 丁香酚麻醉斑點(diǎn)叉尾鮰在不同?；顪囟认卖~肉品質(zhì)的變化
注：A-D表示在同一測(cè)量時(shí)間下數(shù)值差異顯著；a-c表示在同一溫度下數(shù)值差異顯著
2.4 丁香酚麻醉?；顚?duì)斑點(diǎn)叉尾鮰機(jī)體水解氨基酸含量的影響
由表3可知，水解氨基酸總量在無(wú)水?；詈蟮陀诔跏妓剑? ℃?；罱M，人體所需的7種必需氨基酸Lys、Met、Leu、Ile、Thr、Val、Phe值均較?；钋按蠓忍岣撸@示斑點(diǎn)叉尾鮰在2 ℃?；钣休^高的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。
表3 丁香酚麻醉斑點(diǎn)叉尾鮰在不同溫度下無(wú)水保活5 h魚肉中水解氨基酸含量的變化
曾鵬等[32]研究發(fā)現(xiàn)，鯽魚冰溫離水儲(chǔ)藏后，必需氨基酸值大幅提高，多種氨基酸水解含量都高于對(duì)照組鮮魚，有利于營(yíng)養(yǎng)吸收。4 ℃和6 ℃下，各氨基酸成分都有所下降，溫度越高，下降幅度越大。在2 ℃下，各必需氨基酸的增加可能與低溫?；罾溥m應(yīng)后魚體抗凍能力增加，魚體為抵御低溫和重新適應(yīng)正常環(huán)境體內(nèi)正常的代謝活動(dòng)所致[33]。有文獻(xiàn)指出[34]，生活在極地的魚類通過產(chǎn)生抗凍糖肽起到降低冰點(diǎn)抗凍的作用，而4 ℃和6 ℃下無(wú)水?；睿岷拷档?，可能是在此溫度下保活，斑點(diǎn)叉尾鮰代謝率較低溫(0 ℃、2 ℃)要高，食物蛋白質(zhì)經(jīng)過消化吸收獲得氨基酸并參與體內(nèi)代謝，氨基酸為試驗(yàn)魚基礎(chǔ)代謝提供能量物質(zhì)而消耗。據(jù)報(bào)道，支鏈氨基酸可以作為硬骨魚提供能量代謝的物質(zhì)，可為低溫下活魚的代謝提供能量[35]。
3 結(jié)論
丁香酚麻醉斑點(diǎn)叉尾鮰成功無(wú)水?；? h且存活率≥80%的溫度范圍為2 ℃～6 ℃；無(wú)水?；? h后，AST、ALT活性均有顯著升高，而在清水中復(fù)蘇24 h后，2 ℃?；罱M可恢復(fù)至對(duì)照組值；肌酐和尿素氮在?；? h后顯著增加(P<0.05)，對(duì)腎臟造成的不可逆的損傷，在6 ℃下影響最大；蛋白質(zhì)和脂肪等作為能源物質(zhì)被消耗，?；? h后顯著下降(P<0.05)，溫度越高，下降越明顯；質(zhì)構(gòu)指標(biāo)中，硬度、咀嚼性會(huì)顯著下降(P<0.05)，但在清水中復(fù)蘇24 h后顯著上升(P<0.05)，彈性較難恢復(fù)；2 ℃下?；顣r(shí)，8種必需氨基酸含量增加。綜上表明，2 ℃下保活，丁香酚麻醉斑點(diǎn)叉尾鮰無(wú)水保活對(duì)魚肉的生理生化指標(biāo)影響較小，且基本可以恢復(fù)到初始水平，是較適宜的無(wú)水?；顪囟?。該研究結(jié)果揭示了以丁香酚作為麻醉劑，斑點(diǎn)叉尾鮰無(wú)水保活運(yùn)輸過程中不同溫度下的生理生化特點(diǎn)，為進(jìn)一步研究保活過程中斑點(diǎn)叉尾鮰新陳代謝特點(diǎn)提供數(shù)據(jù)支撐和參考。
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