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(北京聯(lián)合大學(xué)生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點實驗室,北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院,北京 100191)

我國擁有歷史悠久的酒文化,同時也擁有數(shù)量龐大的酒精消費人群,但長期大量飲酒會造成酒精性肝損傷,導(dǎo)致肝臟發(fā)生脂肪變性、炎癥、壞死、纖維化或硬化等[1-4]。酒精對肝臟的損傷主要是由于酒精在機體內(nèi),通過引起氧化應(yīng)激導(dǎo)致氧化產(chǎn)物增加,誘使脂肪在肝臟聚集,發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和炎癥反應(yīng),導(dǎo)致肝細胞進一步變成炎癥、壞死、纖維化和硬化[5-7]。目前對于治療酒精性肝損傷尚無特效藥,通常通過補充一些具有抗氧化作用的藥劑如谷胱甘肽、超氧化物歧化酶等可以減少酒精引起的氧化損傷,但其作用機制和副作用等尚未完全明確[4,8]。因此,開發(fā)安全有效的預(yù)防和治療酒精性肝損傷的功能食品和藥品具有重要意義。

雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)是一種淡水單細胞綠藻,隸屬綠藻門、團藻目、紅球藻科、紅球藻屬[9-10]。雨生紅球藻有兩種生長形態(tài),適宜條件下(弱光和氮磷充足)以浮游的綠色營養(yǎng)細胞形式生長,但在不利環(huán)境下,則會形成一層厚壁孢子,同時細胞內(nèi)則累積大量的類胡蘿卜素,主要為蝦青素[11-14],藻源蝦青素是雨生紅球藻的主要活性物質(zhì)。研究表明,雨生紅球藻能夠通過抗氧化作用緩解運動大鼠的心肌損傷[12],白云[15]研究了雨生紅球藻和維生素E聯(lián)用對大鼠由急性酒精引起的肝損傷具有明顯的保護作用,并指出其雨生紅球藻中的蝦青素的抗氧化作用是保護急性酒精肝損傷的主要物質(zhì)。藻源性蝦青素的抗氧化活性已被研究和證實。本研究擬通過建立酒精性肝損傷模型,從肝臟酶活性的變化、炎性因子含量以及肝組織病理切片方面,探討雨生紅球藻破壁孢子粉對酒精所致的小鼠酒精性肝損傷的保護作用,旨在為雨生紅球藻的開發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昆明小鼠 維通梨利華實驗動物有限公司,許可證編號:SCXK(京)2012-0001,SPF級,雄性,體質(zhì)量(25±2) g;雨生紅球藻破壁孢子粉 杭州鑫偉低碳技術(shù)研發(fā)公司提供;總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、還原型谷胱甘肽(glutathione peroxidase,GSH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA) 南京建成生物工程所;小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-1β(IL-1β)酶聯(lián)反應(yīng)測定試劑盒 上海滬尚生物科技有限公司。

UV-2450紫外可見分光光度計 日本津島儀器有限公司;5804R型低溫高速離心機 德國Eppendorf股份有限公司;7180型全自動生化分析儀 日本日立高新技術(shù)公司;電動勻漿器 常州朗越儀器制造有限公司;W201B水浴鍋 上海申順生物科技有限公司;cx23生物顯微鏡 日本奧林巴斯有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠酒精性肝損傷模型的建立 小鼠酒精性肝損傷模型建立是參考了周斌等[16]、以及儲蘭蘭等[17]文獻,再結(jié)合預(yù)實驗結(jié)果,表明此種造模方式在本實驗中效果較好。昆明種小鼠60只,小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后,將小鼠隨機分為正常對照組、模型組、雨生紅球藻破壁孢子粉低(100 mg/kg)、中(200 mg/kg)高(400 mg/kg)劑量組,上述劑量是按照新資源食品對雨生紅球藻的人體推薦量(0.8 g/d)進行設(shè)置,受試物采用雙蒸水進行配制,每組12只。各劑量組每天經(jīng)口灌胃受試物(20 mL/kg),正常對照組和模型組則給予等體積雙蒸水。從實驗第8 d開始,各劑量組先給予受試物,4 h后，各劑量組和模型組再分別給予50%乙醇,正常對照組則給與等體積雙蒸水,連續(xù)7 d。

1.2.2 血清及臟器的采集與制備 末次灌胃后,各組小鼠斷食不斷水16 h。稱重,摘眼球取血,血漿靜置30 min后,于4000 r/min 室溫離心15 min,分離血清置于1.5 mL 離心管中,4 ℃保存。之后小鼠頸椎脫臼處死后解剖,取肝臟,迅速用預(yù)冷的體積分數(shù)為0.9%生理鹽水沖凈表面浮血,濾紙拭干,稱重,用于計算肝臟指數(shù)和各種生化指標。剪取肝左葉組織浸入體積分數(shù)為10%中性多聚甲醛中固定,用于制作石蠟切片,HE染色,于光學(xué)顯微鏡下檢查組織病理學(xué)變化;剪取剩余部分肝組織用于制備10%肝臟組織勻漿液保存待測。

1.3 指標檢測及方法

1.3.1 一般情況觀察 在整個實驗過程中,觀察小鼠的體重變化、進食、毛發(fā)、狀態(tài)、行為及死亡情況,有任何異常情況應(yīng)作記錄。

1.3.2 小鼠肝臟指數(shù)的計算 肝臟指數(shù)(%)=小鼠肝臟重量(g)/小鼠體重(g)×100。

1.3.3 生化指標的檢測 采用全自動生化分析儀測血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)的含量以及甘油三酯(Triglyceride,TG)、總膽固醇(Total cholesterol,TC)的含量;按照試劑盒說明書進行肝勻漿中MDA、GSH含量以及SOD活性測定。

1.3.4 炎性因子檢測 按照試劑盒說明書操作測定肝組織TNF-α和IL-1β含量。

1.3.5 肝臟病理學(xué)檢查 取于10%中性多聚甲醛固定好的肝組織塊,經(jīng)酒精梯度脫水(70%、80%、90%、95%、100%的酒精各脫水30 min)、石蠟包埋、切片、染色之后,于光學(xué)顯微鏡下觀察肝細胞的形態(tài)變化、炎癥反應(yīng)、纖維化、脂肪空泡等病理改變。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,實驗結(jié)果以均值±標準差表示,顯著性檢驗采用單因素方差分析。圖片處理采用OringinPro 2017軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠一般觀察結(jié)果

整個實驗過程中,正常對照組小鼠在體重增長、進食狀況、毛色光澤等方面表現(xiàn)正常,未出現(xiàn)中毒及死亡情況。灌胃酒精后,模型組小鼠和三個劑量組小鼠均開始表現(xiàn)出行走不穩(wěn)、醉倒、嗜睡等現(xiàn)象,模型組小鼠醒酒時間較長,恢復(fù)較慢。實驗中后期,模型組小鼠出現(xiàn)躁動不安、毛色暗淡甚至有輕微脫毛現(xiàn)象,各劑量組小鼠狀態(tài)均有不同程度的改善,毛色也基本趨于正常。

2.2 雨生紅球藻破壁孢子粉對酒精性肝損傷小鼠肝臟指數(shù)的影響

由圖1可知,模型組小鼠的肝臟指數(shù)與正常對照組相比,肝臟指數(shù)極顯著增加(p<0.01),與模型組相比,三個劑量組小鼠肝臟指數(shù)均極顯著降低(p<0.01)。結(jié)果表明,長期給予小鼠酒精灌胃,會使小鼠肝臟發(fā)生腫脹現(xiàn)象,導(dǎo)致肝臟指數(shù)上升。而給予雨生紅球藻破壁孢子粉干預(yù),則能顯著降低小鼠肝臟指數(shù),減輕肝臟損傷,初步說明雨生紅球藻具有一定護肝功能。

圖1 雨生紅球藻破壁孢子粉對小鼠肝臟指數(shù)的影響Fig.1 Effects of Haematococcus pluvialis sporoderm-brokenspore powder on liver index in mice注:*表示與正常對照組比較差異顯著(p<0.05),**表示與正常對照組比較差異極顯著(p<0.01);#表示與模型對照組較差異顯著(p<0.05),##表示與模型對照組比較差異極顯著(p<0.01)。表1～表4同。

2.3 雨生紅球藻破壁孢子粉對酒精性肝損傷小鼠血清ALT和AST含量的影響

ALT和AST作為兩個非特異性細胞內(nèi)功能酶,常用于臨床上評價肝功能[18],機體正常時,其在血清中的含量很低,但當(dāng)肝細胞受到損傷時,血清中ALT和AST含量會顯著增加,所以ALT與AST水平的高低在一定范圍內(nèi)反映機體肝細胞的損傷程度[19]。由表1可知,與對照組比較,模型組小鼠的ALT濃度增加了17.42%,表現(xiàn)出顯著性差異(p<0.05),而AST濃度則增加了31.61%,表現(xiàn)出極顯著性差異(p<0.01),說明模型組小鼠肝臟受到損傷,而ALT升高不夠靈敏,是因為乙醇使得該酶的活性輔助因子B6下降所致[20]。經(jīng)過雨生紅球藻粉干預(yù)的小鼠,與模型組相比,三個劑量組小鼠的AST含量均極顯著下降(p<0.01),ALT有所下降,但是并未出現(xiàn)顯著性差異,可能是由于即使肝臟受到損傷之后,ALT本身上升也不夠靈敏所致。結(jié)果表明,雨生紅球藻能夠顯著降低血清中AST的含量,減輕實驗小鼠由酒精引起的肝損傷。

表1 雨生紅球藻破壁孢子粉對小鼠血清ALT和AST含量的影響(U/L)Table 1 Effects of sporoderm-broken spore powder of Haematococcus pluvialis on ALT,AST content in mice serum(U/L)

2.4 雨生紅球藻破壁孢子粉對酒精性肝損傷小鼠血清TC、TG濃度的影響

血清中TC和TG這兩個指標與脂代謝密切相關(guān),當(dāng)肝臟脂肪過多或者肝臟脂肪代謝能力障礙時,TC和TG含量會隨之升高[21]。由表2知,與正常對照組相比,模型組的TC、TG濃度顯著升高(p<0.05),說明小鼠長期進行酒精灌胃,會導(dǎo)致肝臟TC、TG含量增加。與模型組相比,低劑量組TC水平極顯著降低(p<0.01),中劑量和高劑量組則顯著降低(p<0.05),表明低劑量的雨生紅球藻粉即有顯著作用。與模型組相比,各劑量組的TG濃度則未表現(xiàn)出顯著性差異(p>0.05),表明雨生紅球藻粉可能對于由酒精引起的肝臟TG水平的升高無明顯降低效果,無論劑量高低。以上結(jié)果表明,雨生紅球藻破壁孢子粉能夠?qū)τ删凭鹦∈蟾闻KTC、TG含量的增加具有良好的緩解作用。

表2 雨生紅球藻破壁孢子粉對小鼠血清TC、TG含量的影響(mmol/L)Table 2 Effects of sporoderm-broken spore powder of Haematococcus pluvialis on TC,TG contents in mice serum(mmol/L)

2.5 雨生紅球藻破壁孢子粉對酒精性肝損傷小鼠肝臟抗氧化作用的影響

表3 雨生紅球藻破壁孢子粉對小鼠肝臟MDA含量及SOD活力、GSH含量的影響Table 3 Effects of sporoderm-broken spore powder of Haematococcus pluvialis on MDA and GSH contents,SOD activity in mice liver

2.6 雨生紅球藻破壁孢子粉對小鼠肝臟炎性因子TNF-α和IL-1β含量的影響

腫瘤壞死因子TNF-α和白介素IL-1β是兩個重要的促炎因子[26],小鼠體內(nèi)在受到酒精長期刺激后,體內(nèi)發(fā)生炎性反應(yīng),促炎因子的含量則會增加。由表4知,與正常對照組相比,模型組小鼠肝臟TNF-α和IL-1β濃度極顯著增加(p<0.01),說明小鼠在長期酒精的作用下,小鼠體內(nèi)發(fā)生了炎癥損傷,導(dǎo)致肝臟炎性因子水平升高。與模型組相比,各劑量組的TNF-α均表現(xiàn)出下降,其中,中劑量組顯著下降(p<0.05),高劑量組極顯著下降(p<0.01),各劑量組的IL-1β含量與模型組相比,均極顯著降低(p<0.01)。以上結(jié)果表明,雨生紅球藻破壁孢子粉能夠減輕小鼠由酒精刺激所致的炎癥損傷,并且對IL-1β的清除效果更好。

表4 雨生紅球藻破壁孢子粉對小鼠肝臟TNF-α、IL-1β含量的影響(ng/L)Table 4 Effects of sporoderm-broken spore powder ofHaematococcus pluvialis on TNF-α,IL-1β contents in mice liver(ng/L)

2.7 雨生紅球藻粉對小鼠肝組織病理學(xué)的影響

由圖2可知,正常對照組小鼠肝細胞索結(jié)構(gòu)清晰,以小葉中央靜脈為中心呈放射狀排列,肝小葉內(nèi)網(wǎng)狀纖維支架結(jié)構(gòu)完整,分布規(guī)律,匯管區(qū)及其周圍無炎癥細胞浸潤,肝細胞無明顯的脂肪變性、水腫、壞死等,排列整齊(圖2a);模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰,細胞核被擠壓至邊界,肝索排列不規(guī)則,大量細胞邊界模糊不清并出現(xiàn)壞死(圖2b);低劑量組與模型情況類似,但可見的損傷程度明顯減輕(圖2c);高劑量組肝索排列較為整齊,組織結(jié)構(gòu)趨于正常(圖2d)。病理組織形態(tài)學(xué)觀察提示:雨生紅球藻對酒精所致小鼠急性肝損傷具有一定的保護作用。

圖2 雨生紅球藻對小鼠肝組織病理的影響(HE,×200)Fig.2 Effects of Haematococcus pluvialis on pathological injury of mice liver注:a:正常對照組;b:模型組;c:低劑量組;d:高劑量組。

3 討論與結(jié)論

自80年代對酒精性肝損傷發(fā)病機制深入研究之后,便已證實乙醇具有直接的肝毒性[27]。有新的研究表明,酒精性肝損傷主要來自于其代謝產(chǎn)物乙醛在體內(nèi)積累所引起的各種氧化損傷,甚至?xí)?dǎo)致基因突變[28]。當(dāng)體內(nèi)乙醇過量時,一方面,代謝產(chǎn)物乙醛則能通過不同的途徑對機體造成損傷;另一方面,乙醇也能直接刺激活性氧自由基的產(chǎn)生,對機體具有極強的攻擊性[31]。與此同時,為拮抗體內(nèi)過多的活性氧自由基,也會加快SOD和GSH的耗竭[32]。因此,通過增強體內(nèi)代謝乙醇及其產(chǎn)物的酶的活性或是增強機體的抗氧化能力,對治療酒精性肝損傷具有極其重要的意義。

實驗結(jié)果表明,經(jīng)雨生紅球藻干預(yù)后,實驗小鼠的肝臟指數(shù)顯著降低,血清中ALT和AST含量顯著降低,肝臟SOD活性和GSH含量顯著增加,脂質(zhì)過氧化物MDA含量顯著降低,炎性因子TNF-α和IL-1β含量均顯著降低,肝臟病理情況也得到明顯改善。綜上所述,雨生紅球藻破壁孢子粉對小鼠肝損傷具有顯著的保護作用,其作用機制可能與增強小鼠的抗氧化能力減輕炎癥反應(yīng)相關(guān),具體的作用機制本實驗室將繼續(xù)研究,以期為雨生紅球藻作為食品的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。