梁仁政,吉光榮

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨七科，哈爾濱 150001)

自噬是一種細(xì)胞保護(hù)機(jī)制，可以降解細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等，從而維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。然而過度的自噬也可引起細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器等的過度降解，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。自噬與凋亡是細(xì)胞程序性死亡的兩種方式，兩者在發(fā)生過程中存在交叉，對(duì)于通過自噬無(wú)法處理的細(xì)胞，最終可能會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。骨肉瘤是一種常見的，嚴(yán)重威脅兒童和青少年健康的惡性骨腫瘤[1]，來源于骨骼系統(tǒng)的結(jié)締組織，尤其好發(fā)于多發(fā)性骨髓瘤患者。70%的骨肉瘤患者的發(fā)病年齡為10～25歲，臨床表現(xiàn)為疼痛和腫脹[2]，如延誤診斷，會(huì)因腫瘤壓迫導(dǎo)致皮膚表面緊縮以及淺表靜脈曲張。骨肉瘤開放性活檢手術(shù)后常發(fā)生病理性骨折[3]。骨肉瘤可發(fā)生在任何骨骼，以長(zhǎng)骨干垢端多見，膝關(guān)節(jié)最常受累，發(fā)生于膝關(guān)節(jié)的骨肉瘤占所有骨肉瘤的50%[4]。骨肉瘤具有浸潤(rùn)性和遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移性，易發(fā)生血行轉(zhuǎn)移，最常轉(zhuǎn)移至肺。骨肉瘤惡性程度高且預(yù)后差，2年存活率僅為15%～20%[5]。大部分高分化骨肉瘤患者在手術(shù)治療前通常輔以順鉑、阿霉素以及甲氨蝶呤等化療3個(gè)月。近年來，隨著大劑量聯(lián)合化療的應(yīng)用，無(wú)轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者5年生存率可達(dá)55%～70%，但發(fā)生轉(zhuǎn)移者5年生存率僅為5%～20%[6-7]。雖然輔助化療顯著提高了骨肉瘤患者的生存率，但仍有一些問題存在，如嚴(yán)重不良反應(yīng)、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移性并發(fā)癥等，而化療耐藥是目前骨肉瘤治療的難點(diǎn)之一?，F(xiàn)就自噬與凋亡對(duì)骨肉瘤發(fā)生以及治療的作用予以闡述。

1 細(xì)胞凋亡的相關(guān)分子機(jī)制

對(duì)于骨肉瘤的治療，最重要的是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制骨肉瘤生長(zhǎng)。近年來隨著新藥物的應(yīng)用，患者的預(yù)后雖然有所改善，但化療耐藥仍普遍存在，成為骨肉瘤治療的難點(diǎn)[8]。凋亡信號(hào)的識(shí)別與促細(xì)胞凋亡藥物的研發(fā)為骨肉瘤的治療提出了新的策略[9]。

1.1凋亡信號(hào)通路 細(xì)胞凋亡是為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因調(diào)控的細(xì)胞自主的有序的死亡。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)14種凋亡相關(guān)蛋白，主要包括凋亡啟動(dòng)因子、凋亡效應(yīng)因子以及炎癥因子。凋亡信號(hào)通路包括外源性凋亡途徑和內(nèi)源性凋亡途徑。外源性凋亡途徑是由死亡配體與死亡受體結(jié)合引發(fā)。死亡受體屬于腫瘤壞死因子受體超家族，包括腫瘤壞死因子受體1、Fas、重組人死亡受體3、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體2、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體受體1、死亡受體6、異位受體蛋白A以及神經(jīng)生長(zhǎng)因子，其誘導(dǎo)死亡信號(hào)復(fù)合體組裝，包括Fas相關(guān)死亡域蛋白(Fas-associating protein with a novel death domain，F(xiàn)ADD)和啟動(dòng)子蛋白胱天蛋白酶(caspase)-8/10。在復(fù)合物中，F(xiàn)ADD與caspase-8/10相互作用介導(dǎo)FADD蛋白的水解和caspase-8/10的激活，激活的caspase-8/10裂解并激活效應(yīng)蛋白(caspase-3、6、7)，隨后靶向裂解一系列細(xì)胞底物，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

內(nèi)源性凋亡途徑是由多種細(xì)胞內(nèi)刺激因素誘導(dǎo)的[10]。在這條通路上，線粒體膜溶解導(dǎo)致促凋亡蛋白從線粒體膜間隙進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，這個(gè)過程依賴于凋亡小體。凋亡小體包括細(xì)胞凋亡蛋白酶原9、凋亡蛋白酶活化因子1以及細(xì)胞色素C，其可導(dǎo)致caspase-9的聚集和活化，活化的caspase-9切割并激活下游的效應(yīng)凋亡蛋白酶(caspase-3、6、7)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。外源性和內(nèi)源性凋亡通路存在共同點(diǎn)，在擴(kuò)大凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮著積極作用。

1.2微RNA(micorRNA，miRNA)調(diào)節(jié)骨肉瘤細(xì)胞凋亡 p53、p21、胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor,IGF)1、結(jié)構(gòu)性轉(zhuǎn)錄因子2、第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10,PTEN)、蛋白激酶B等在凋亡通路中發(fā)揮著重要作用。有研究提出，miRNA通過調(diào)控制骨肉瘤細(xì)胞中與化學(xué)耐藥相關(guān)的因子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[11]。miR-140的異常過度表達(dá)，增加了p53和p21蛋白的表達(dá)，提高了骨肉瘤對(duì)甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶的敏感性[12]。此外，miR-199a和miR-34a通過p53信號(hào)通路誘導(dǎo)人骨肉瘤細(xì)胞凋亡[13]。而miR-26a可靶向作用于IGF-1，抑制IGF-1在骨肉瘤中的表達(dá)，從而抑制腫瘤[14]。在骨肉瘤中，通過減少BCL2L2、MCL-1、IGF受體、MET等的表達(dá)，增加磷酸化蛋白激酶B和局部黏著斑激酶的表達(dá)也可起到抑制腫瘤的作用[15]。在人類骨肉瘤細(xì)胞中，miR-23a靶向調(diào)節(jié)PTEN的3′-非翻譯區(qū)，并負(fù)相調(diào)節(jié)PTEN的表達(dá)，通過激活蛋白激酶B/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶通路，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[16]。

1.3骨肉瘤中調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的化合物 多柔比星和星形孢菌素可靶向誘導(dǎo)骨肉瘤U2OS細(xì)胞系中caspase-3和7的活化，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。開瑞坦可通過上調(diào)caspase-3和cspase-9的表達(dá)，增加caspase-3的裂解水平，抑制人骨肉瘤細(xì)胞在體外的增殖[18]。黃芩素可通過線粒體途徑誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡，又可通過上調(diào)熱激蛋白70的表達(dá)，部分阻止人骨肉瘤細(xì)胞的凋亡，并降低骨肉瘤對(duì)黃芩素的敏感性[19]。環(huán)糊精角叉菜堿、IGF-I受體酪氨酸激酶抑制劑可通過聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1及其裂解產(chǎn)物，抑制多重耐藥的骨肉瘤細(xì)胞增殖，并促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡。環(huán)氧霉素(蛋白酶抑制劑)能顯著提高caspase-3、caspase-8、caspase-9的活性以及Bax蛋白的水平，誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡[20]。

1.4骨肉瘤中調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的蛋白因子 抑癌蛋白M屬于白細(xì)胞介素6家族，通過激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子、p53以及核轉(zhuǎn)移，增加Bax/Bcl-2的比值，最終導(dǎo)致成骨細(xì)胞凋亡[21]。Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx2)家族的轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的作用，Runx2可直接靶向作用于Bax，是骨肉瘤細(xì)胞的促凋亡因子。此外，Runx2的丟失促進(jìn)了骨肉瘤對(duì)化療誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的敏感性[22]。FOXO轉(zhuǎn)錄因子，特別是FOXO1，在骨肉瘤細(xì)胞中通過Wnt/β聯(lián)蛋白途徑，起抑制腫瘤細(xì)胞的作用[23]。放線菌素D是一種廣為人知的轉(zhuǎn)錄抑制劑，通過增加裂解的caspase-3和放線菌素D的水平和治療時(shí)間，抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡[24]。EZH2是聚合酶抑制劑2的催化亞基，敲除EZH2可導(dǎo)致抗凋亡的Bcl-2降低，增加促凋亡的Bax、Bak以及細(xì)胞色素C在細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)，表明EZH2通過內(nèi)源性凋亡途徑抑制細(xì)胞凋亡[25]。另外，EZH2也可通過負(fù)性調(diào)控兩種促細(xì)胞凋亡的miR-205和miR-31，抑制細(xì)胞凋亡[26]。

2 自噬的相關(guān)分子機(jī)制

至今，自噬對(duì)骨肉瘤化療敏感性和化療耐藥的作用尚未明確。在骨肉瘤治療過程中，自噬既可以提高化學(xué)敏感性，也可以提高化學(xué)耐藥性。

2.1自噬的信號(hào)通路 自噬是一個(gè)高度保守的程序，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏、生長(zhǎng)因子、激素、細(xì)胞內(nèi)能量信息以及細(xì)胞應(yīng)激如缺氧、病毒感染等均可觸發(fā)。目前為止，共發(fā)現(xiàn)30多個(gè)自噬相關(guān)基因(autophagy associated gene,Atg)[27]。一些分子復(fù)合物在自噬過程中是必不可少的，根據(jù)其在自噬過程中的功能分為Atg1蛋白激酶復(fù)合物、Ⅲ類磷脂酰肌醇-3-激酶、Beclin1、Atg12共軛系統(tǒng)、Atg8共軛系統(tǒng)以及Atg9。Atg1蛋白激酶復(fù)合物是誘導(dǎo)自噬所必需的；Ⅲ類磷脂酰肌醇-3-激酶-Beclin1復(fù)合物是囊泡融合所必需的；Atg12-Atg5共軛結(jié)構(gòu)對(duì)于囊泡的延展是必要的。

2.2自噬與骨肉瘤的治療

2.2.1自噬提高化療的敏感性 類黃酮黃體素通過上調(diào)beclin1的表達(dá)，促進(jìn)阿霉素誘導(dǎo)的人類骨肉瘤U2OS細(xì)胞自噬，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，導(dǎo)致U2OS細(xì)胞死亡[28]。雄烯二酮衍生物在化療藥物的作用下，通過降低高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein，HMGB1)的水平，提高化學(xué)敏感性，克服骨肉瘤耐藥性[29]。雙吲哚生物堿沃卡胺是一種自噬誘導(dǎo)劑，對(duì)野生型和多重耐藥的腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用，其通過增加微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)的表達(dá)和轉(zhuǎn)化促進(jìn)細(xì)胞凋亡[30]。2-甲氧基雌二醇在自噬相關(guān)蛋白7(autophagy-related protein 7，ATG7)表達(dá)的條件下，通過誘導(dǎo)LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ，促進(jìn)人類骨肉瘤細(xì)胞自噬體形成[31]。此外，自噬可能在抗2-甲氧基雌二醇介導(dǎo)的骨肉瘤中起重要作用。

2.2.2自噬與骨肉瘤的化學(xué)耐藥性 在骨肉瘤細(xì)胞中，HMGB1的水平是升高的，其介導(dǎo)的自噬也會(huì)促進(jìn)化療耐藥[32]。miR-22在化療期間可代償性增多，過度表達(dá)的miR-22靶向作用于HMGB1，從而抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移，并抑制其介導(dǎo)的自噬[32-33]。上調(diào)HMGB1可增加磷脂酰肌醇-3-激酶復(fù)合物的形成，并通過與Bcl-2競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Beclin1，刺激自噬體成熟。HMGB1和自噬的抑制增加了體內(nèi)外骨肉瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性，且HMGB1與Beclin1的相互作用需要人類unc-51樣激酶1(unc-51-like kinase 1，ULK1)復(fù)合物的存在，其相互作用促進(jìn)磷脂酰肌醇-3-激酶復(fù)合體在自噬過程中的形成，提示HMGB1介導(dǎo)的自噬促進(jìn)了骨肉瘤細(xì)胞的耐藥[34]。另外，高遷移率族核小體結(jié)合的結(jié)構(gòu)域5在骨肉瘤中高表達(dá)，特別是在治療后的腫瘤中。過度表達(dá)的高遷移率族核小體結(jié)合的結(jié)構(gòu)域5降低了體外骨肉瘤細(xì)胞的化學(xué)敏感性，并通過上調(diào)自噬以及ULK1、Beclin1和LC3-Ⅱ/Ⅰ的水平增加耐藥性[35]。miR-101降低了Atg4的水平，Atg4是兩個(gè)共軛系統(tǒng)的調(diào)節(jié)器，在骨肉瘤中可抑制阿霉素誘導(dǎo)的自噬囊泡的形成，并通過miR-101抑制自噬和骨肉瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性[36]。

3 自噬與凋亡的相互作用

自噬在骨肉瘤進(jìn)展中的確切作用目前尚不清楚。有報(bào)道稱，自噬既可以促進(jìn)細(xì)胞存活也可以促進(jìn)細(xì)胞死亡[37]。自噬與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，深入了解自噬，并利用自噬調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡對(duì)骨肉瘤的治療有重要意義。

3.1細(xì)胞凋亡與自噬具有協(xié)同作用 二氨基吖啶具有劑量依賴性抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖的作用，并通過協(xié)調(diào)細(xì)胞凋亡與自噬發(fā)揮抗癌作用[38]。南蛇藤醇是一種三萜烯藥物，具有強(qiáng)效的抗腫瘤作用，其在骨肉瘤細(xì)胞中通過活性氧類/c-Jun氨基端激酶信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬[39]。

3.2自噬與細(xì)胞凋亡之間的對(duì)抗關(guān)系 Beclin1是一種重要的自噬調(diào)節(jié)蛋白，與許多疾病如癌癥、衰老以及退行性疾病相關(guān)。Atg6和Beclin1可使腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲以及轉(zhuǎn)移減少，表明抑制自噬對(duì)化療誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性有積極作用，增加了抗癌藥物的治療功效[40]。熱激蛋白90抑制劑格爾德霉素通過抑制蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白/p70S6K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在KTHOS細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬[41]。在KTHOS細(xì)胞中，格爾德霉素也能誘導(dǎo)凋亡蛋白酶依賴性凋亡通路，與自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤聯(lián)合，可增強(qiáng)其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[41]。在骨肉瘤細(xì)胞中，雷帕霉素可抑制細(xì)胞增殖，并減少哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白通路成分磷酸化骨肉瘤細(xì)胞，Spautin-1(一種新型自噬抑制劑)可抑制雷帕霉素誘導(dǎo)的保護(hù)機(jī)制，從而有效誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡[42]。 Dihydroptychantol A是一種大環(huán)雙聯(lián)芐衍生物，在人類骨肉瘤中可誘導(dǎo)自噬以及與p53途徑相關(guān)的凋亡。此外，敲除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶R樣蛋白激酶受體可抑制自噬，最終導(dǎo)致骨肉瘤細(xì)胞凋亡[43]。

4 結(jié) 語(yǔ)

關(guān)于細(xì)胞凋亡和自噬如何影響骨肉瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，以及影響骨肉瘤耐藥的潛在因素已經(jīng)探討了很多，但仍有很多問題需要解決。目前關(guān)于骨肉瘤的治療，耐藥是最大阻礙。自噬到底是增強(qiáng)還是降低了骨肉瘤的耐藥，目前還尚未研究清楚。此外，細(xì)胞自噬與凋亡之間的相互作用很復(fù)雜，自噬可提高細(xì)胞的生存能力和壞死細(xì)胞數(shù)量；而細(xì)胞凋亡、自噬均可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的死亡，但相互作用途徑還有待研究，深入了解細(xì)胞的自噬與凋亡，也為骨肉瘤的治療提供新的方法。