貴州馬鈴薯晚疫病菌群體遺傳多樣性分析

楊 露， 王 勇*， 吳石平

(1.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽 550025； 2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所， 貴州 貴陽 550006)

馬鈴薯晚疫病是馬鈴薯生產(chǎn)上最嚴(yán)重的病害，影響馬鈴薯質(zhì)量和產(chǎn)量。群體遺傳多樣性是抗病性研究和應(yīng)用的基礎(chǔ)，馬鈴薯晚疫病是由致病疫霉(Phytophthorainfestans)引起的真菌病害，世界各地馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，嚴(yán)重影響馬鈴薯生產(chǎn)[1-3]。1845年，馬鈴薯晚疫病首次在愛爾蘭流行，引起“愛爾蘭饑饉”[4]。隨后在荷蘭、法國、英國等國家迅速傳播，在潮濕條件下，能在1周內(nèi)導(dǎo)致馬鈴薯全田發(fā)病死亡[5-6]。2004年，據(jù)全球晚疫病協(xié)作網(wǎng)(GILB)統(tǒng)計(jì)，每年僅在發(fā)展中國家因馬鈴薯晚疫病直接造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)32.5億美元，同時(shí)殺菌劑的花費(fèi)高達(dá)7.5億美元[7]。目前，我國種馬鈴薯的地帶幾乎都有晚疫病的發(fā)生[8]。

植物病原菌的遺傳多樣性研究是控制病害的基礎(chǔ)，遺傳多樣性的變化是晚疫病和銹病等很多重要作物抗性病害流行的基礎(chǔ)。生理小種是晚疫病遺傳多樣性的重要表現(xiàn)型之一[9]，1919年，馬鈴薯晚疫病菌群體的生理分化現(xiàn)象首次被發(fā)現(xiàn)[10]。1953年，BLACK等提出了馬鈴薯晚疫病菌生理小種命名方法[11]，其后很多學(xué)者對(duì)馬鈴薯晚疫病的生理小種進(jìn)行測(cè)定[12-13]。馬鈴薯晚疫病菌線粒體單倍型是馬鈴薯晚疫病遺傳多樣性的另一重要指標(biāo)，其 DNA分子量小，結(jié)構(gòu)簡單，進(jìn)化速度快，無組織特異性，且為單親遺傳，因此廣泛用于鑒定馬鈴薯晚疫病菌的遺傳多樣性分析[14-16]。

貴州是馬鈴薯主要生產(chǎn)地之一，目前貴州馬鈴薯晚疫病菌遺傳多樣性研究較少，筆者采用鑒別寄主法和PCR-RFLP法分析貴州馬鈴薯晚疫病菌群體遺傳多樣性，從而為貴州省選育抗病品種以及防治馬鈴薯晚疫病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 2017-2018年共采集32個(gè)縣的馬鈴薯晚疫病標(biāo)本，通過單孢分離法獲得113個(gè)菌株，及2008年分離保存的15個(gè)菌株，總菌株為128株。

1.1.2 培養(yǎng)基 成分：60 g黑麥，20 g葡萄糖，12 g瓊脂粉，50 mL番茄汁。

1.1.3 生理小種鑒別寄主 供試鑒別寄主均為無菌的試管苗，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供，基因型分別為r、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11。除r不含抗病基因感病寄主外，其余均為抗病單基因材料。

1.2 生理小種測(cè)定

1.2.1 鑒別寄主的準(zhǔn)備 用MS培養(yǎng)基將鑒別寄主試管苗培養(yǎng)生根后移植于有珍珠巖的基質(zhì)花盆內(nèi)栽培，在溫室培養(yǎng)60 d，待植株葉片長至1 cm左右時(shí)用于接種。

1.2.2 供試菌種的準(zhǔn)備 將分離純化后的菌株接在黑麥培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d，用移液槍向培養(yǎng)皿內(nèi)打入5 mL的無菌水配制成孢子囊懸浮液，過濾，用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)算菌株的孢子囊數(shù)，孢子囊的含量大于103個(gè)/mL方可用于測(cè)定[17]。

1.2.3 接種方法 取鑒別寄主的葉片用無菌水清洗3遍，用吸水紙吸干水后反面放于已滅菌的12%的水瓊脂培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿3個(gè)鑒別寄主，每個(gè)鑒別寄主重復(fù)3次，汲取50 μL孢子囊懸浮液滴在每片葉的背面，每片葉滴2滴，17～19℃暗箱培養(yǎng)24 h，第2天后在17～19℃白晝交替培養(yǎng)4 d，第5天觀察發(fā)病情況[18]。

1.2.4 病情調(diào)查以及生理小種的確定 用顯微鏡檢查接種發(fā)病部位，有孢子囊產(chǎn)生的部位為感病，不產(chǎn)生孢子囊的為抗病，參照BLACK等[11]生理小種的命名確定生理小種。

1.2.5 DNA提取 收集在黑麥培養(yǎng)基中培養(yǎng)的20～25 d的菌絲體于研磨中，加液氮研磨成粉末狀后，用植物DNA提取試劑盒提取菌絲基因組DNA。

1.2.6 引物的選擇 參照GRIFFITH等[15]的方法選擇2對(duì)引物(F2：5′-TTCCCTTTGTCCTCT

ACCGAT-3′、R2: 5′-TTACGGCGGTTTAGCAC

AATACA-3;F4:5′-TGGTCATCCAGAGGTTTA

TGTT-3′、R4: 5′-CCGATACCGATACCAGCAC

CAA-3′)，產(chǎn)物分別為P2、P4，片段長度分別為1 070 bp和964 bp。

1.2.7 PCR擴(kuò)增、酶切及電泳 PCR和酶切參照試劑盒說明書進(jìn)行。酶切產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳，凝膠成像儀拍照。參照GRIFFITH等的方法可將馬鈴薯晚疫病菌線粒體DNA單倍型劃分為4種類型，即Ⅰa、Ⅱa、Ⅰb、Ⅱb型[15]。P2片段(1 070 bp)被MspⅠ酶切成350 bp、720 bp 2個(gè)片段，或147 bp、203 bp、720 bp 3個(gè)片段，或79 bp、350 bp、641 bp 3個(gè)片段，P4片段(964 bp)被EcoR1酶切成361 bp、603 bp 2個(gè)片段、或209 bp、361 bp、394 bp 3個(gè)片段。若被測(cè)樣本的P2產(chǎn)物被MspⅠ酶切成350 bp、720 bp，同時(shí)P4產(chǎn)物被EcoRⅠ酶切成209 bp、361 bp、394 bp，則該樣本的線粒體單倍型為Ⅰa型，若被測(cè)樣本的P2產(chǎn)物被MspⅠ酶切成147 bp、203 bp、720 bp，同時(shí)P4產(chǎn)物被EcoRⅠ酶切成361 bp、603 bp，則該樣本的線粒體單倍型為Ⅱa型，若被測(cè)樣本的P2產(chǎn)物被MspⅠ酶切成79 bp、350 bp、641 bp，同時(shí)P4產(chǎn)物被EcoRⅠ酶切成209 bp、361 bp、394 bp，則該樣本的線粒體單倍型為Ⅰb型，若被測(cè)樣本的P2產(chǎn)物被MspⅠ酶切成350 bp、720 bp，同時(shí)P4產(chǎn)物被EcoRⅠ酶切成361 bp、603 bp，則該樣本的線粒體單倍型為Ⅱb型。

2 結(jié)果與分析

2.1 生理小種

試驗(yàn)結(jié)果(圖1)表明，貴州省馬鈴薯晚疫病菌致病基因類型較為豐富，除了R7未檢測(cè)到，共檢測(cè)到10個(gè)致病基因。從10個(gè)致病基因出現(xiàn)頻率看，致病基因R2最高，達(dá)100%，在所有菌株中均存在；R4、R8、R9和R6等4個(gè)致病頻率較高，分別為97.66%，73.44%、66.41%、60.94%，R11和R3出現(xiàn)頻率較低，分別為5.47%和7.81%。

圖1 單基因致病頻率Fig.1 Pathogenic frequency of Single gene

從生理小種組成看，128個(gè)菌株中鑒定出19種生理小種，復(fù)合型生理小種占主導(dǎo)地位，有3個(gè)菌株為單致病基因的生理小種，小種組成為2，采集地為水城和盤縣。組成較為復(fù)雜的生理小有4種，分別為1.2.3.4.6.8、2.4.6.8.9.11、2.4.5.6.8.9和2.3.4.6.9.10，這些小種能克服馬鈴薯的6個(gè)抗性基因。

從各地區(qū)生理小種出現(xiàn)的頻率(表1)看，生理小種2.4.6.8.9占的比例最大，達(dá)25.78%，出現(xiàn)的地域最廣，32個(gè)縣中有11個(gè)縣有分布，為貴州的優(yōu)勢(shì)小種。另外毒力最強(qiáng)的4個(gè)小種分別是2.4.5.6.8.9、2.4.6.8.9.11、2.3.4.6.9.10和1.2.3.4.6.8，頻率分別為12.5%、3.91%、1.56%和1.56%，雖然毒力最強(qiáng)，但出現(xiàn)頻率低，地域不廣，不是優(yōu)勢(shì)小種。

表1 不同地區(qū)馬鈴薯晚疫病生理小種的出現(xiàn)頻率Table 1 Frequency of physiological races of P. infestans in different regions

2.2 線粒體DNA單倍型

從圖2看出，貴州馬鈴薯晚疫病菌線粒體DNA單倍型主要以Ⅰa型和Ⅱb型為主，分別占78.91%和21.09%，未發(fā)現(xiàn)其他線粒體單倍型。從表2看出，Ⅰa型共101株，頻率最高，占78.91%，分別來自都勻、普安等20個(gè)縣。Ⅱb型27株，占21.09%，分別來自荔波、平壩等15個(gè)縣。同時(shí)檢測(cè)出有Ⅰa型和Ⅱb型的地區(qū)為普定、遵義、威寧。

注：M為標(biāo)準(zhǔn)分子量，1～4為P4 產(chǎn)物的 EcoR1酶切圖譜，5～8為P2 的PCR 產(chǎn)物的Msp1的酶切圖譜。Note: M, Maker, 1-4,restriction enzyme mapping of P4 using Eco R1; 5-8, restriction enzyme mapping of P2 using Msp1.

表2 mtDNA單倍型及其頻率分布Table 2 Distribution of mtDNA haplotype and its frequency

3 結(jié)論與討論

生理小種結(jié)果顯示：貴州大部分地區(qū)馬鈴薯晚疫病菌群體生理小種已呈多樣性和復(fù)雜化，復(fù)合性的生理小種占主導(dǎo)地位，單基因生理小種出現(xiàn)比例非常小。在測(cè)定的128個(gè)菌株中，共發(fā)現(xiàn)19個(gè)生理小種，其中生理小種2.4.6.8.9出現(xiàn)的頻率最高，達(dá)25.78%，同時(shí)出現(xiàn)的地域最廣，32個(gè)縣中有11個(gè)縣均有分布，分別是都勻、麻江、荔波、惠水、水城、普安、威寧、金沙、黔西、赫章及畢節(jié)，已成為貴州的優(yōu)勢(shì)小種；其次是2.4.5.6.8.9出現(xiàn)的頻率較高，為12.50%，也是最為復(fù)雜的小種之一，但地域有限，32個(gè)縣中只有4個(gè)縣出現(xiàn)，分別是普安、三都、榕江及赫章。最復(fù)雜的另外3個(gè)小種分別是1.2.3.4.6.8、2.4.6.8.9.11和2.3.4.6.9.10，能夠克服6個(gè)抗性基因，頻率分別為1.56%、3.91%和1.56%。雖然這些生理小種發(fā)生的頻率較低，但將來一旦發(fā)展成為優(yōu)勢(shì)小種，會(huì)使許多抗病馬鈴薯品種失去抗病性，同時(shí)也會(huì)給抗病育種帶來較為嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

楊勝先等[13]測(cè)定貴州2013—2014年馬鈴薯晚疫病菌的生理小種，其優(yōu)勢(shì)小種為2.5.6.8.9.11，與本試驗(yàn)的優(yōu)勢(shì)小種2.4.6.8.9不同，可能是采集年限不同，也可能是當(dāng)年的氣候條件或采集地點(diǎn)不同導(dǎo)致。但比較發(fā)現(xiàn)，隨時(shí)間推移貴州馬鈴薯晚疫病菌生理小種在發(fā)生一定的變化。

線粒體DNA單倍型結(jié)果顯示，貴州主要以Ⅰa和Ⅱb型2種單倍型，具有多態(tài)性。另外，Ⅰb型為古老菌系，Ⅰa、Ⅱa、Ⅱb型屬于新演化菌系[2]，未檢測(cè)到Ⅰb和Ⅱa型，而Ⅰa和Ⅱb型屬于演化菌系，由于缺乏更早期的數(shù)據(jù)支持，很難確定群體遷移替代時(shí)間。Ⅱb型主要分布在貴州南面，Ⅰa分布在貴州北面，可能是南面氣溫較北面高適合Ⅱb型馬鈴薯晚疫病菌系生長，北面適合Ⅰa型菌系生長。

貴州馬鈴薯晚疫病存在多樣性，生理小種類型和線粒體DNA單倍型不存在必然聯(lián)系，同一生理小種類型的菌株其線粒體DNA有的是Ⅰa型，有的是Ⅱb型，線粒體DNA單倍型相同的菌株其生理小種也不一定相同。