李夢(mèng)姝，孫福亮，柳儉強(qiáng)，曹 陽(yáng)，李兆華，金海國(guó)，張立春*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延邊130021；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林公主嶺136100)

腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)是由活化的單核- 巨噬細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子。TNF-α 在機(jī)體天然免疫系統(tǒng)中起重要的作用，除了能夠殺傷腫瘤細(xì)胞，刺激單核- 巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子外，還能夠誘導(dǎo)促炎癥反應(yīng)及多種免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)，是維持機(jī)體穩(wěn)定、抵御各種致病因子必不可少的免疫調(diào)節(jié)因子，在炎性反應(yīng)、細(xì)胞免疫、腫瘤免疫等多種生理和病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1]。與此同時(shí)TNF-α 基因異常同樣可以對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重危害[2]。研究報(bào)道表明TNF-α 的啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性與多種疾病的易感性密切相關(guān)。人及其它物種TNF-α 基因均含有豐富的多態(tài)性[3-5]。研究顯示豬TNF-α 基因啟動(dòng)子區(qū)的G-791 位點(diǎn)多態(tài)性影響TNF-α 基因mRNA 的表達(dá)，提示TNF-α 基因多態(tài)性可以作為抗逆性相關(guān)的遺傳標(biāo)記[6]。本研究室前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣表明在相同條件下，不同遺傳背景豬群血清TNF-α 含量存在極顯著差異，表現(xiàn)為野雜豬和民豬極顯著高于大白豬，推測(cè)野雜豬和民豬TNF-α 基因啟動(dòng)子區(qū)可能存在促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄翻譯的調(diào)控元件并可能在高抗逆性狀構(gòu)成中發(fā)揮一定的作用[7]。對(duì)3 個(gè)豬群體TNF-α編碼區(qū)的序列分析并未顯示其存在單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)(SNP)。基于此，本實(shí)驗(yàn)采用高分辨率熔解曲線方法(HRM)分析了不同遺傳背景豬的TNF-α 基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性，及該多態(tài)性與血清中TNF-α 含量的相關(guān)性，為深入研究TNF-α 基因抗病功能、不同遺傳背景豬群體抗病抗逆性狀的遺傳機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)樣品采集 野豬(含75 %長(zhǎng)白山野豬血統(tǒng))與當(dāng)?shù)孛褙i的雜交豬(簡(jiǎn)稱野雜豬)(30頭)、民豬(25 頭)及純種大白豬健康后備母豬(29 頭)分別來(lái)自吉林省白山市隆興牧業(yè)有限公司興隆豬場(chǎng)、吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧分院民豬保種場(chǎng)和四平紅嘴集團(tuán)梨樹種豬場(chǎng)，均為5 月齡～6 月齡。實(shí)驗(yàn)樣品為3 個(gè)豬群體外周血，部分用于分離血清，采用ELISA 法檢測(cè)血清TNF-α 含量，部分血液樣品經(jīng)ACD 抗凝，按照DNA 提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行外周血DNA 的提取。

1.2 主要試劑 血液DNA 提取試劑盒購(gòu)自Axygen公司；TaqMasterMix、DNA Marker 均購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；基因分型試劑盒Light cycler 480 High Resolution Melting Master 購(gòu)自羅氏公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 參照GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中豬TNF-α 基因啟動(dòng)子區(qū)序列(GQ339057.1)設(shè)計(jì)引物TNF-α-P1 及多態(tài)性檢測(cè)引物TNF-α-P2 (表1)。引物均由新海基因檢測(cè)有限公司合成。

1.4 不同遺傳背景豬群體TNF-α 基因擴(kuò)增及其SNP 鑒定 以野雜豬、民豬及大白豬外周血的DNA 為模板，以TNF-α-P1 為引物擴(kuò)增其TNF-α 基因啟動(dòng)子區(qū)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、回收純化后由金唯智生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAStar 軟件分析，尋找TNF-α 基因啟動(dòng)子SNP 位點(diǎn)并對(duì)其中的G-1256、G-1239 進(jìn)行基因多態(tài)性分析。

表1 引物序列信息Table 1 Information of the primers

1.5 TNF-α 基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性檢測(cè)及分析 采用HRM 法利用TNF-α-P2 的上下游引物PCR 擴(kuò)增TNF-α 基因啟動(dòng)子區(qū)，擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行HRM 分型，分型條件為：95 ℃1 min，40 ℃1 min，65 ℃1 s；在65 ℃升溫至95 ℃的過(guò)程中以25 次/℃的速度收集熒光，最后降溫至40 ℃。檢測(cè)結(jié)果經(jīng)Gene scanning 軟件進(jìn)行分析，根據(jù)得到的基因型，挑選部分樣品由金唯智生物公司測(cè)序分析。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用SPSS23 軟件，經(jīng)單因素方差分析方法分別對(duì)3 個(gè)不同群體豬個(gè)體TNF-α 基因啟動(dòng)子區(qū)的基因型與其血清TNF-α 含量進(jìn)行差異顯著性分析。

1.7 TNF-α 基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)利用轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)JASPAR (http://jaspar.genereg.net)，分析本實(shí)驗(yàn)獲得的TNF-α 基因啟動(dòng)子區(qū)的單倍型個(gè)體核苷酸序列，遴選出因堿基突變導(dǎo)致的潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的變化。

2 結(jié) 果

2.1 不同遺傳背景豬群體TNF-α 基因啟動(dòng)子區(qū)克隆與其SNP 鑒定 以野雜豬、民豬及大白豬外周血基因組DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增出該3 個(gè)群體TNF-α 基因啟動(dòng)子區(qū)，片段約為1.6 kb (圖1)。對(duì)PCR 產(chǎn)物測(cè)序并進(jìn)行多態(tài)位點(diǎn)篩查，結(jié)果顯示3 個(gè)群體TNF-α 基因啟動(dòng)子區(qū)存在7 個(gè)SNP (表2)。表明3 個(gè)不同群體豬TNF-α 基因啟動(dòng)子區(qū)存在堿基突變，因此對(duì)其進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 TNF-α 基因啟動(dòng)子區(qū)的PCR 擴(kuò)增Fig.1 Amplification of TNF-α gene promoter region by PCR

表2 TNF-α 基因啟動(dòng)子區(qū)的SNPTable 2 The SNP of TNF-α

2.2 不同遺傳背景豬群體TNF-α 基因啟動(dòng)子多態(tài)性分析 選取TNF-α 基因啟動(dòng)子G-1256、G-1239位點(diǎn)區(qū)作為研究對(duì)象，通過(guò)HRM 方法對(duì)3 個(gè)不同遺傳背景豬群體進(jìn)行基因型檢測(cè)。Gene scaning 分析結(jié)果顯示3 個(gè)群體豬中該區(qū)域基因型主要分為4種類型，依次命名為AA、BB、CC 和DD (圖2)，且3 個(gè)群體豬的該區(qū)域基因型頻率存在明顯差異。其中CC 基因型在3 個(gè)豬群體中均表現(xiàn)為優(yōu)勢(shì)基因型，尤以野雜豬群體CC 基因型頻率最高，達(dá)73 %(22/30)，民豬群體次之，達(dá)52 % (13/25)，大白豬最低，僅31 % (9/29)(表3)。 將PCR 產(chǎn)物測(cè)序分析，結(jié)果顯示BB 和CC 基因型個(gè)體為純合型，G-1256位點(diǎn)均為G，G-1239 位點(diǎn)分別是G 和A，DD 基因型G-1239 位點(diǎn)為A/G 雙峰，表明DD 基因型為BB、CC 基因型的雜合型。AA 基因型則相對(duì)復(fù)雜，其在G-1256 和G-1239 位點(diǎn)均表現(xiàn)為A/G 雙峰(圖2)。由于該區(qū)域基因型由2 個(gè)SNP 組成，結(jié)合測(cè)序結(jié)果顯示3 個(gè)群體中該區(qū)域?qū)嶋H上存在3 種單倍型(Haplotype)，即：GG、GA 和AG。但鑒于AA 基因型個(gè)體數(shù)量稀少且僅在大白豬群體中存在，推測(cè)G-1256 A 可能在大白豬品種培育過(guò)程中通過(guò)突變產(chǎn)生了新的多態(tài)位點(diǎn)。由于不同遺傳背景豬TNF-α 基因啟動(dòng)子區(qū)基因型種類與頻率的差異性，提示自然狀態(tài)下該區(qū)域可能承受較大的環(huán)境選擇壓力。

圖2 3 個(gè)豬群體TNF-α 基因啟動(dòng)子區(qū)HRM 分型(A)與測(cè)序結(jié)果(B)Fig.2 The genotyping (A)and sequencing (B)of TNF-α gene promoter region from three pig populations by HRM

表3 3 個(gè)群體豬TNF-α 基因啟動(dòng)子區(qū)基因型頻率及SNP 分析Table 3 The genotype frequences and the polymorphisms on TNF-α gene promoter region in three pig population

2.3 TNF-α 基因啟動(dòng)子多態(tài)性與血清TNF-α 含量相關(guān)性分析 為探究該基因座位多態(tài)性是否對(duì)TNF-α 基因轉(zhuǎn)錄及分泌產(chǎn)生影響，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步以3 個(gè)群體不同個(gè)體的TNF-α 基因啟動(dòng)子區(qū)基因型與血清中該基因含量進(jìn)行相關(guān)性分析。3 個(gè)群體分別進(jìn)行獨(dú)立單因素方差分析結(jié)果顯示，野雜豬和大白豬TNF-α 基因啟動(dòng)子區(qū)CC 基因型個(gè)體血清TNF-α含量顯著高于其它基因型個(gè)體(p＜0.05)。盡管民豬CC 基因型個(gè)體血清中該基因含量與其它品種豬相比并未表現(xiàn)出顯著性差異，但其血清TNF-α 含量卻表現(xiàn)出高于其它基因型個(gè)體的趨勢(shì)(圖3)。將3 個(gè)群體作為一個(gè)整體進(jìn)行單因素方差分析同樣顯示CC基因型個(gè)體血清TNF-α 含量顯著高于BB 基因型及DD 基因型(p＜0.05)。提示CC 基因型在提高TNF-α基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)方面可能具有普遍性。

圖3 3 個(gè)群體不同基因型豬血清TNF-α 的含量差異顯著性分析Fig.3 The contrast of TNF-α in the peripheral blood of different genotype in three pig populations

2.4 TNF-α 基因啟動(dòng)子區(qū)潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè) 截取一定長(zhǎng)度GG、GA 和AG 單倍型序列，利用JASPAR 數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析工具進(jìn)行潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示不同單倍型序列潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)存在較大差異。其中GA 單倍型預(yù)測(cè)潛在轉(zhuǎn)錄因子27 個(gè)；GG 單倍型30 個(gè)；AG 單倍型16 個(gè)。其中3 種類型單倍型共同擁有1 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，GA 和GG 單倍型共有20 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子潛在識(shí)別位點(diǎn)；GG 和AG 共有9 個(gè)；GA 和AG 單倍型則沒(méi)有(圖4)。進(jìn)一步分析顯示僅GA 和AG 單倍型存在自身特異性轉(zhuǎn)錄因子。其中GA 單倍型存在與免疫相關(guān)的潛在NF-κB 亞基RelB 因子結(jié)合位點(diǎn)，而AG單倍型潛在轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別位點(diǎn)與免疫因子轉(zhuǎn)錄調(diào)控?zé)o關(guān)，表明RelB 因子在TNF-α 基因的轉(zhuǎn)錄中起重要調(diào)控作用。

圖4 不同單倍型序列轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)與分析Fig.4 Prediction and analysis of transcription factors of different haplotypes sequences

3 討 論

我國(guó)地方豬種類資源豐富、種質(zhì)特性鮮明、抗病性能高，豬的抗病抗逆性狀是由微效多基因控制的數(shù)量性狀[8]，目前尚未對(duì)地方豬抗病性狀進(jìn)行有效解析。本研究室在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在相同條件下，野雜豬、民豬及大白豬健康群體血清TNF-α 含量存在顯著差異，提示TNF-α 可能參與高抗病性狀的構(gòu)建[7]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)該3 種豬的TNF-α 基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性進(jìn)行檢驗(yàn)，并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析了血清TNF-α 含量。結(jié)果顯示3 個(gè)群體TNF-α 啟動(dòng)子區(qū)不同基因型與血清TNF-α 含量存在一定的相關(guān)性，為解析不同遺傳背景豬血清TNF-α 含量差異的遺傳基礎(chǔ)提供了參考依據(jù)。

目前豬TNF-α 基因編碼區(qū)尚未發(fā)現(xiàn)存在基因多態(tài)性，基因多態(tài)性主要存在于其啟動(dòng)子區(qū)。Szydlowsk 等發(fā)現(xiàn)大白豬TNF-α 基因啟動(dòng)子區(qū)G-791 位點(diǎn)發(fā)生的C→T 突變，該位點(diǎn)可能與大白豬背膘厚等經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)[6]。而孫麗等利用PCR-SSCP 方法分析了大白豬TNF-α 基因啟動(dòng)子區(qū)G-791 位點(diǎn)的多態(tài)性，結(jié)果表明G-791 位點(diǎn)可能影響TNF-α 基因mRNA 的表達(dá)且TT 基因型個(gè)體TNF-α 基因mRNA 在十二指腸和空腸顯著上調(diào)表達(dá)[9]。除大白豬外，其它品種豬TNF-α 基因啟動(dòng)子區(qū)同樣存在多態(tài)位點(diǎn)。牛步月等利用直接測(cè)序法證實(shí)民豬、長(zhǎng)白豬TNF-α基因5' 側(cè)翼區(qū)存在G-1048 多態(tài)位點(diǎn)，并進(jìn)一步證實(shí)不同基因型對(duì)仔豬腹瀉和生長(zhǎng)性狀有一定影響[10]。本實(shí)驗(yàn)利用測(cè)序?qū)σ半s豬、民豬和大白豬TNF-α 基因啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行了多態(tài)性篩查，結(jié)果表明3 個(gè)群體豬該區(qū)段的確存在SNP。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)序方法在受試豬群體TNF-α 基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)共計(jì)7 個(gè)SNP，但對(duì)上述3 個(gè)群體豬TNF-α 基因編碼區(qū)進(jìn)行克隆，測(cè)序結(jié)果顯示編碼區(qū)不存在包括無(wú)義突變?cè)趦?nèi)的任何堿基突變，表明不同遺傳背景豬TNF-α 基因氨基酸序列的保守性(數(shù)據(jù)未顯示)。提示豬TNF-α 基因啟動(dòng)子區(qū)受到的選擇壓力較小，且其TNF-α 基因可能主要通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)而非功能改變來(lái)調(diào)節(jié)其在免疫反應(yīng)中的功能。

不同于傳統(tǒng)的PCR-SSCP、PCR-RFLP 等SNP 研究方法，本實(shí)驗(yàn)采用低成本、高通量、快速的HRM法分析了TNF-α 基因啟動(dòng)子G-1256 和G-1239 區(qū)的基因型，顯示3 個(gè)豬群基因型及基因型頻率存在較大差別：大白豬群體存在4 種基因型，民豬3 種，野雜豬則只有2 種。本實(shí)驗(yàn)中AA、BB 新基因型在民豬和大白豬群體內(nèi)的出現(xiàn)提示隨著選育進(jìn)程的增加，該區(qū)域SNP 可能經(jīng)歷從開(kāi)始產(chǎn)生并逐漸增加的過(guò)程。目前普遍認(rèn)為豬馴化或選育過(guò)程中一般伴隨著抗病性能及抗性相關(guān)基因遺傳多樣性能丟失，本研究室對(duì)上述3 個(gè)豬群體Mx1基因的研究也證明了此觀點(diǎn)[11]。但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果似乎提示TNF-α 基因啟動(dòng)子區(qū)隨著選育進(jìn)程的增加其遺傳多樣性也呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。綜合考慮不同基因型與血清TNF-α 含量相關(guān)性分析結(jié)果即可推測(cè)出新的突變位點(diǎn)G-1256 A 的出現(xiàn)很可能抑制了TNF-α 基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而間接降低了血清TNF-α 含量，表明新的突變位點(diǎn)極有可能是有害突變。也從側(cè)面提示在現(xiàn)代豬品種選育，規(guī)?；曫B(yǎng)模式及環(huán)境控制水平不斷提升的客觀條件下，可能降低了包括TNF-α 基因在內(nèi)的相關(guān)免疫基因的環(huán)境選擇壓力，從而導(dǎo)致豬種環(huán)境適應(yīng)能力的降低。TNF-α 基因轉(zhuǎn)錄受到NF-κB 信號(hào)通路的調(diào)控，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析顯示G-1239 A 構(gòu)成NF-κB 信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄因子RelB 潛在結(jié)合位點(diǎn)，而該位點(diǎn)所構(gòu)成的CC 基因型在野雜豬中頻率最高，結(jié)合CC 基因型個(gè)體在豬群體中血清TNF-α 含量顯著上升的結(jié)果，提示RelB 在TNF-α 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程發(fā)揮著重要作用，也間接表明TNF-α 基因啟動(dòng)子區(qū)NF-κB 轉(zhuǎn)錄信號(hào)識(shí)別區(qū)的增減對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要作用?？紤]到高抗逆表型豬群(野雜豬)具有更高的血清TNF-α 含量，且該表型豬群優(yōu)勢(shì)基因型(CC 基因型)構(gòu)成RelB 潛在結(jié)合位點(diǎn)，表明NF-κB信號(hào)通路在抗逆表型構(gòu)成中可能具有重要作用，但其具體功能尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。