韋艷娜，張珍珍，王 麗，王 佳，陳 蓉，馮志新，邵國(guó)青，熊祺琰

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210014)

豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是豬支原體肺炎(俗稱(chēng)豬氣喘病)的病原體，該病呈世界性分布，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。國(guó)內(nèi)外大多采用疫苗防控該疾病，豬支原體肺炎168 株活疫苗由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)所研制，保護(hù)效率高于滅活疫苗，得到市場(chǎng)好評(píng)。目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上豬支原體肺炎活疫苗的免疫途徑主要是胸腔注射(豬支原體肺炎Z 株活疫苗)或肺內(nèi)注射(豬支原體肺炎168 株活疫苗)、滴鼻免疫(豬支原體肺炎R(shí)M48株活疫苗)，對(duì)于豬支原體肺炎168 株活疫苗而言肺內(nèi)注射的免疫途徑給豬場(chǎng)實(shí)際使用造成一定的不便，滴鼻、氣霧免疫等黏膜免疫途徑具有操作便利、動(dòng)物應(yīng)激小等優(yōu)勢(shì)，因此該免疫途徑成為進(jìn)一步研究該疫苗免疫效力的主要方向。

佐劑可提高疫苗免疫效果，為增加經(jīng)滴鼻免疫途徑的豬支原體肺炎168 株活疫苗的免疫效果，本研究擬開(kāi)發(fā)一種適合于Mhp 活疫苗使用的黏膜佐劑。目前研究較多的黏膜佐劑包括殼聚糖、細(xì)菌毒素、CpG、PolyI:C、納米乳等[2-3]?；魜y毒素B 亞單位(Cholera toxin subunit B，CTB)是霍亂腸毒素的無(wú)毒亞基，能夠與大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面的神經(jīng)節(jié)苷脂(Monosialoganglioside，GM1)特異性結(jié)合，可使與其連接的抗原蛋白更易與黏膜作用，進(jìn)而引起免疫機(jī)體一系列生理生化反應(yīng)，使其產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫效果[4]。Hou 等將CTB 作為黏膜佐劑與HIV-1 DNA疫苗聯(lián)合后免疫小鼠可誘導(dǎo)其產(chǎn)生高水平的Th1 和Th2 型細(xì)胞因子、炎癥細(xì)胞因子和趨化因子，同時(shí)提高血清中Env 蛋白的IgG 抗體水平[5]；Miyata 等將CTB 與蛋白MSP1-19 耦合可增強(qiáng)小鼠對(duì)瘧原蟲(chóng)的抗感染作用，通過(guò)滴鼻和皮下注射，均可提高血清和支氣管肺泡灌洗液中的IgG 抗體水平[6]。可見(jiàn)CTB 作為一種良好的黏膜免疫佐劑和抗原遞送載體，可以用于增強(qiáng)疫苗的免疫效果。

P97 蛋白是目前研究最為深入的Mhp 表面黏附因子，其中的P97R1 (R1 區(qū))是直接參與Mhp 黏附細(xì)胞的區(qū)域，也是其主要的抗原決定簇[7-8]，為少數(shù)被證明具備免疫保護(hù)能力的抗原之一[9-10]?；诖耍狙芯吭O(shè)計(jì)并表達(dá)了rCTB-P97R1 重組蛋白，將其與豬支原體肺炎活疫苗混合后滴鼻免疫小鼠，以評(píng)價(jià)其對(duì)該活疫苗黏膜免疫效果的增強(qiáng)作用。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 豬支原體肺炎(168株)活疫苗，批號(hào)20170518，由本實(shí)驗(yàn)室制備；含CTB 基因的重組質(zhì)粒pET-CTB-p277 由中國(guó)藥科大學(xué)微基因藥物實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)[11]；BL21(DE3)化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；P97R1單克隆抗體(MAb)2A10 由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存[12]。40 只雌性BALB/c 小鼠，體質(zhì)量18 g～22 g，購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)比較中心。

1.2 主要試劑 質(zhì)?？焖傩×砍樘嵩噭┖匈?gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA 回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；山羊抗兔HRP-IgG 購(gòu)自武漢博士德生物公司；兔源抗CTB 抗體購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自Biosharp 生物科技有限公司；商品化CTB 購(gòu)自Sigma 公司；GM1 購(gòu)自百靈威科技有限公司；TMB 顯色液和BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；山羊抗鼠HRP-IgG 購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；低分子蛋白Marker 購(gòu)自Promega公司；His-Tag 親合層析柱購(gòu)自金斯瑞生物技術(shù)有限公司。

1.3 重組質(zhì)粒pET-CTB-P97R1 的構(gòu)建與鑒定根據(jù)GenBank 中Mhp P97 基因序列(U50901)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增P97 基因R1 區(qū)，上下游引物P97R1-up：5'-A AAGCTAGCTTACCTCAGCCGCCAGCA-3' (NheⅠ)/P97R1-down： 5'-TTTCTCGAGAGCCATTGGGAAAT AGTCTT-3' (XhoⅠ)。以Mhp 168 株DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增P97 基因R1 重復(fù)區(qū)。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃10 min ；94 ℃60 s、54 ℃60 s、72 ℃ 30 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR 產(chǎn)物回收純化后，用NheⅠ和XhoⅠ雙酶切后克隆至pET-CTB-p277 載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-CTB-P97R1。PCR 檢測(cè)后由金斯瑞生物技術(shù)有限公司測(cè)序鑒定。

1.4 重組蛋白(rCTB-P97R1)的表達(dá)、純化及鑒定將pET-CTB-P97R1 轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600nm值為0.4～0.6，加入IPTG 至終濃度為1.0 mmol/L，37℃振蕩培養(yǎng)4 h～6 h，離心收集菌體， 超聲裂解后收集沉淀和上清， 利用SDS-PAGE 分析重組蛋白表達(dá)，同時(shí)對(duì)重組蛋白經(jīng)親和層析純化，用15 % SDS-PAGE 分析純度。以P97R1 MAb 2A10 為一抗(1 ∶2 000 倍)，山羊抗鼠HRP-IgG 為二抗(1∶10 000 倍)，western blot 鑒定重組蛋白。

1.5 rCTB-P97R1 與GM1 結(jié)合能力的檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[13]GM1-ELISA 方法，用GM1 (5 μg/mL)包被過(guò)夜后與不同濃度的CTB-P97R1 (從5 μg/mL 開(kāi)始，2 倍倍比稀釋?zhuān)敝罜TB-P97R1 濃度為0.005 μg/mL)孵育，以兔抗CTB 抗體(1∶4 000 倍)為一抗，山羊抗兔HRP-IgG (1∶8 000 倍)為二抗，檢測(cè)CTB-P97R1 與GM1 的結(jié)合能力，同時(shí)使用相同濃度的商品化CTB蛋白作為對(duì)照進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。同時(shí)將各重組蛋白與商品化CTB 蛋白均于100 ℃水浴處理5 min 后檢測(cè)其與GM1 的結(jié)合能力。

1.6 動(dòng)物分組及免疫 選取BALB/c 小鼠隨機(jī)分成4 組，每組10 只，分別設(shè)為rCTB-P97R1+豬支原體肺炎(168 株)活疫苗免疫組(免疫0.3 mg rCTB-P97R1+107CCU 活疫苗)，rCTB-P97R1 對(duì)照組(免疫0.3 mg rCTB-P97R1)，豬支原體肺炎(168 株)活疫苗對(duì)照組(免疫107CCU 活疫苗)和陰性對(duì)照組，每只小鼠滴鼻免疫50 μL，2 周后以相同方式加強(qiáng)免疫1 次。

1.7 小鼠IgG 抗體及sIgA 抗體的檢測(cè) 在二次免疫后7 d、14 d、21 d 和28 d 分別對(duì)小鼠進(jìn)行眼框采血，分離血清，-20 ℃保存，用于檢測(cè)血清中Mhp、P97R1 的IgG 抗體水平[12,14]；在二次免疫后7 d迫殺小鼠，氣管插管注入1 mL PBS，輕輕揉捏胸腔后回抽液體，收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)，-20 ℃保存，用于檢測(cè)BALF 中Mhp、P97R1 的sIgA 抗體水平[15]。

1.8 數(shù)據(jù)分析 所得數(shù)據(jù)均采用SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1 pET28a-CTB-P97R1 的構(gòu)建與鑒定 以Mhp 168 株DNA 為模板，P97R1-up/P97R1-down 為引物，PCR 擴(kuò)增其P97 基因的R1 區(qū)片段P97R1，將該基因片段克隆至pET-CTB-p277 中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET- CTB-P97R1。對(duì)構(gòu)建的pET-CTB-P97R1 進(jìn)行PCR 鑒定，結(jié)果顯示PCR 擴(kuò)增出約300 bp 的基因片段，與預(yù)期一致(圖1)。重組質(zhì)粒序列測(cè)定結(jié)果顯示，其基因序列與設(shè)計(jì)的CTB-P97R1 基因片段完全一致，表明正確構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-CTB-P97R1。

圖1 重組質(zhì)粒pET-CTB-P97R1 的PCR 鑒定Fig.1 Identification of the recombinant plasmid pET-CTB-P97R1 by PCR

2.2 rCTB-P97R1 的表達(dá)及純化 pET-CTB-P97R1/BL21 重組菌液經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE 檢測(cè)結(jié)果顯示在21.5 ku 處出現(xiàn)目的蛋白條帶(圖2)，且rCTB-P97R1 存在于裂解上清中，用His-Tag 親合層析柱純化重組蛋白，經(jīng)western blot 鑒定結(jié)果顯示，在21.5 ku 處出現(xiàn)目的條帶，與SDS-PAGE 中純化蛋白的位置一致，表明rCTB-P97R1 得到了表達(dá)，且具有較好的反應(yīng)原性。

2.3 rCTB-P97R1 與GM1 結(jié)合能力的測(cè)定 通過(guò)GM1-ELISA 方法檢測(cè)rCTB-P97R1 與GM1 的結(jié)合能力。結(jié)果顯示，rCTB-P97R1 可以與GM1 結(jié)合，且隨著rCTB-P97R1 濃度的降低，其與GM1 結(jié)合能力下降，具有劑量依賴(lài)性。而不同濃度的rCTB-P97R1經(jīng)過(guò)加熱處理后，其與GM1 結(jié)合能力均喪失。商品化CTB 與GM1 的結(jié)合能力也隨濃度降低而下降，且熱處理后不同濃度的CTB 與GM1 結(jié)合能力也均喪失。本實(shí)驗(yàn)制備的rCTB-P97R1 的GM1 結(jié)合能力與商品化CTB 結(jié)合GM1 的能力相當(dāng)(圖3)。表明rCTB-P97R1 較好地保持了天然CTB 的體外生物活性。

圖2 rCTB-P97R1 重組蛋白的表達(dá)純化和western blot 鑒定Fig.2 The detection of the rCTB-P97R1 expression, purification by SDS-PAGE and identification of the rCTB-P97R1 by western blot

圖3 rCTB-P97R1 與GM1 結(jié)合能力的檢測(cè)Fig.3 GM1-binding ability of rCTB-P97R1

2.4 免疫后小鼠血清IgG 抗體水平的檢測(cè) 于二次免疫后7 d、14 d 、21 d、28 d 采血分離血清進(jìn)行抗體檢測(cè)。結(jié)果顯示陰性對(duì)照組和rCTB-P97R1 免疫組小鼠均不能產(chǎn)生Mhp 全菌蛋白抗體?；钜呙鐚?duì)照組能夠產(chǎn)生較強(qiáng)的Mhp 全菌蛋白抗體，而rCTB-P97R1+ 活疫苗免疫組小鼠該抗體水平更高，在二次免疫后7 d、14 d 、21 d 與活疫苗對(duì)照組相比差異極顯著(p＜0.01)，在二次免疫后28 d 差異顯著(p＜0.05)(圖4A)。表明rCTB-P97R1 對(duì)豬支原體肺炎活疫苗的免疫刺激能力有顯著的增強(qiáng)作用。

通過(guò)檢測(cè)小鼠血清中的P97R1 抗體水平結(jié)果顯示，活疫苗對(duì)照組不能有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對(duì)P97R1 抗原的抗體，與陰性對(duì)照組無(wú)差異。rCTBP97R1+ 活疫苗免疫組和rCTB-P97R1 組均能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的P97R1 抗體，且該兩組誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的P97R1 抗體水平無(wú)顯著差異(p＞0.05)，但其與活疫苗對(duì)照組相比均差異極顯著(p＜0.01)(圖4B)，結(jié)果表明rCTB-P97R1 能夠誘導(dǎo)小鼠對(duì)P97R1 抗原的體液免疫應(yīng)答。

圖4 免疫小鼠血清中IgG 抗體檢測(cè)Fig.4 Detection of IgG antibody in mice serum after immunization

2.5 免疫后小鼠BALF 中sIgA 抗體水平的檢測(cè)通過(guò)檢測(cè)二次免疫后7 d 的BALF 中sIgA 抗體，結(jié)果顯示rCTB-P97R1+活疫苗免疫組誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗Mhp 全菌蛋白的sIgA 抗體，與活疫苗對(duì)照組相比差異顯著(p＜0.05)，但其針對(duì)P97R1 的sIgA 抗體與其它組相比升高不顯著(p＞0.05)(圖5)。表明重組蛋白rCTB-P97R1 與活疫苗聯(lián)合使用能夠顯著增強(qiáng)小鼠針對(duì)全菌蛋白抗原的黏膜免疫反應(yīng)。

圖5 小鼠免疫7 d 后BALF 中sIgA 抗體檢測(cè)Fig.5 Detection of sIgA antibody in BALF of the mice 7 days after second immunization

3 討 論

黏膜是機(jī)體免疫防御的第一道防線(xiàn)，在防御細(xì)菌、病毒等病原體引起的呼吸道及腸道感染中起主要作用。黏膜免疫與自然感染最接近，是呼吸道疾病免疫預(yù)防的理想途徑。但由于黏膜表面特殊的理化性質(zhì)，減弱了黏膜免疫應(yīng)答的強(qiáng)度，甚至常常導(dǎo)致免疫耐受。良好的黏膜免疫佐劑能夠幫助疫苗提高黏膜免疫能力，使少量的抗原即可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生早期、高效且持久的免疫應(yīng)答。CTB 是較為常用的黏膜免疫佐劑之一，其具有很強(qiáng)的增強(qiáng)黏膜局部及系統(tǒng)免疫應(yīng)答的能力且去除了A 亞基保證了良好的安全性[4]。CTB 在黏膜免疫中的機(jī)制主要包括促進(jìn)抗原通過(guò)黏膜屏障，加強(qiáng)抗原被樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)和其它抗原提呈細(xì)胞(APC)的提呈作用，增強(qiáng)抑制性T 細(xì)胞分泌TGF-β1[16]。CTB 可以與抗原偶聯(lián)、融合或直接與抗原混合，有效發(fā)揮佐劑作用[17-18]。

Mhp 致病的先決條件是其對(duì)豬呼吸道支氣管上皮細(xì)胞的特異性黏附，因此有效誘導(dǎo)對(duì)重要黏附因子的免疫應(yīng)答具有重要意義。P97 蛋白是參與Mhp黏附豬支氣管上皮細(xì)胞的主要因子。研究表明，P97 蛋白的主要功能域位于C 端，其中R1 區(qū)是直接參與黏附的區(qū)域，也是主要的抗原決定簇。已有多個(gè)研究室以P97 或其R1 重復(fù)區(qū)為抗原嘗試重組疫苗的研究[19-20]。

本研究采用基因工程技術(shù)將CTB 與P97R1 區(qū)基因串聯(lián)經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)了重組融合蛋白rCTB-P97R1，經(jīng)GM1-ELISA 方法檢測(cè)，顯示rCTB-P97R1 與GM1 的結(jié)合能力與商品化的CTB 相當(dāng)，表明偶聯(lián)于C 端的P97R1 分子并未影響CTB 的構(gòu)象，重組蛋白很好地保持了天然CTB 分子的佐劑活性。將CTB-P97R1與Mhp 168 活疫苗混合滴鼻免疫后，顯著提高了小鼠血清中的全菌蛋白IgG 抗體水平及BALF 中的sIgA 抗體水平，表明rCTB- P97R1 很好地發(fā)揮了黏膜佐劑作用，顯著提升了小鼠呼吸道局部粘膜免疫應(yīng)答。同時(shí)，血清中針對(duì)Mhp P97R1 的IgG 抗體也顯著升高，表明rCTB- P97R1 蛋白還可以強(qiáng)化對(duì)Mhp 重要抗原P97R1 的免疫應(yīng)答水平，更有利于對(duì)疾病的防御。

值得注意的是BALF 中針對(duì)P97R1 的sIgA 抗體并不明顯，可能與P97R1 劑量低有一定關(guān)系，提示單獨(dú)使用rCTB-P97R1 作為重組疫苗滴鼻免疫小鼠其免疫效果可能較有限，不一定能夠產(chǎn)生有效免疫保護(hù)。目前對(duì)Mhp 的重組疫苗也有報(bào)道，但能夠提供有效保護(hù)的重組疫苗并不多。與病毒不同，細(xì)菌的抗原成分非常復(fù)雜，對(duì)于細(xì)菌性疫苗而言重組疫苗的研制更加困難，僅依靠一種或少數(shù)抗原免疫往往效果不佳[21-22]。目前，基于完整細(xì)菌的活疫苗或滅活疫苗仍是細(xì)菌疫苗研制的主要方向，而向這類(lèi)疫苗中補(bǔ)充關(guān)鍵的保護(hù)性抗原或許成為提升疫苗效果的途徑之一。對(duì)于Mhp 重組疫苗而言，還需要更多的研究篩選鑒定其保護(hù)性抗原，并進(jìn)行合理的優(yōu)化組合，并配合佐劑研究才有可能獲得免疫效果較為滿(mǎn)意的疫苗。

綜上所述，本研究構(gòu)建、表達(dá)、純化了重組蛋白rCTB-P97R1，利用小鼠動(dòng)物模型驗(yàn)證了其可以顯著增強(qiáng)豬支原體肺炎活疫苗的滴鼻免疫效力，同時(shí)可提升小鼠對(duì)P97R1 關(guān)鍵抗原的免疫應(yīng)答。小鼠免疫試驗(yàn)數(shù)據(jù)可為后續(xù)的本動(dòng)物免疫效力試驗(yàn)提供參考，同時(shí)為后期開(kāi)發(fā)經(jīng)滴鼻途徑免疫的豬支原體肺炎活疫苗提供了數(shù)據(jù)支持。