安 童 張小奕 李紅霞 滿 永 竇 琳 黃秀清 唐蔚青

動(dòng)脈內(nèi)膜下巨噬細(xì)胞大量吞噬修飾的低密度脂蛋白而形成富含膽固醇酯的泡沫細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵步驟[1]。巨噬細(xì)胞膽固醇反向轉(zhuǎn)運(yùn)即巨噬細(xì)胞通過(guò)其表面轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將膽固醇流出到細(xì)胞外的接受體并轉(zhuǎn)運(yùn)回肝臟進(jìn)行代謝的過(guò)程，已被認(rèn)為具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[2]；而巨噬細(xì)胞膽固醇流出是巨噬細(xì)胞膽固醇反轉(zhuǎn)運(yùn)的第一步也是關(guān)鍵步驟[3-5]。因此促進(jìn)巨噬細(xì)胞膽固醇流出對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的防治具有十分重要的意義。

G蛋白偶聯(lián)受體120（G protein-coupled receptor 120，GPR120）是具有7次跨膜保守結(jié)構(gòu)的視紫紅質(zhì)家族受體，長(zhǎng)鏈脂肪酸是其天然配體，化合物GW9508也可以激活GPR120。激活的GPR120可拮抗細(xì)菌脂多糖和腫瘤壞死因子等誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥，促進(jìn)巨噬細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化[6-7]。然而，GPR120在巨噬細(xì)胞膽固醇代謝中的作用未見(jiàn)報(bào)道，本文以GW9508激活RAW264.7巨噬細(xì)胞GPR120，研究其在膽固醇流出中的作用及可能的機(jī)制。

材料與方法

1.材料 RAW264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；GW9508購(gòu)自美國(guó)Cayman公司；載脂蛋白（apolipoprotein，apo）A1、高密度脂蛋白（high density lipoproteins，HDL）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）購(gòu)自美國(guó)sigma公司；NBD-膽固醇（22-（N-（7-Nitrobenz-2-Oxa-1，3-Diazol-4-yl）Amino）-23，24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol）、Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、MTS購(gòu)自Promega公司；2xSYBR購(gòu)自日本Takara公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；PCR引物由北京賽百盛生物公司合成；兔抗人ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體（ATP-binding cassette，ABC）A1和G1和B族清道夫受體1（Scavenger receptor class B type 1，SR-B1）單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)NOVUS公司；鼠抗人β-actin單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔和羊抗鼠IgG相關(guān)抗原抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物公司。

2.方法 （1）RAW264.7細(xì)胞在含10%FBS、青霉素（105U/L）、鏈霉素（105U/L）的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

（2）將RAW264.7細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)；換含0.2%BSA的DMEM培養(yǎng)基，負(fù)載2μg/mL熒光標(biāo)記的膽固醇（NBD-TC）24 h；經(jīng)含0.2%BSA的DMEM培養(yǎng)基平衡細(xì)胞12 h后；用50～200μmol/L的GW9508處理細(xì)胞18 h；換無(wú)酚紅的DMEM培養(yǎng)基（含15μg/mL apo-A1和35μg/mL HDL）孵育細(xì)胞5h；收集培養(yǎng)基，同時(shí)用1N的氫氧化鈉破碎細(xì)胞；使用熒光酶標(biāo)儀（激發(fā)波長(zhǎng)485nm，發(fā)射波長(zhǎng)535nm）分別測(cè)量培養(yǎng)基及細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。膽固醇流出率為：培養(yǎng)基的熒光強(qiáng)度/（培養(yǎng)基的熒光強(qiáng)度+細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度）×100%。

（3）將RAW264.7細(xì)胞接種于96孔板中培養(yǎng)；用50～200μmol/L的GW9508處理細(xì)胞18h；每孔加入40μL的MTS試劑，培養(yǎng)箱孵育4 h；于酶標(biāo)儀490nm處讀取各孔吸光值；以空白對(duì)照組吸光度值為基準(zhǔn)，計(jì)算細(xì)胞存活率。

（4）50～200μmol/L的GW9508處理RAW264.7細(xì)胞18h，用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。將25μg蛋白經(jīng)8%的SDS-PAGE凝膠電泳分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。于含5%脫脂牛奶的TBST中室溫封閉2 h；用相應(yīng)抗體（ABCA1、ABCG1、SR-B1、β-actin）于4℃孵育24 h后，TBST洗膜；用與一抗相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗于室溫孵育PVDF膜2 h；TBST洗膜后用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

（5）100和200μmol/L的GW9508處理RAW264.7細(xì)胞18h，用Trizol提取總RNA；經(jīng)DNA酶處理后，將2μg的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。定量PCR反應(yīng)體系為20μL，含0.2 ng的cDNA，5 pmol/L引物，和10μL 2xSYBR。定量PCR反應(yīng)條件為：50℃，2 min；95℃，10 min；95℃，15 s；60℃，1 min，循環(huán)40次。引物序列見(jiàn)表1。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 檢測(cè)基因的引物序列

結(jié) 果

1.GPR120激動(dòng)劑GW9508促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的NBD-膽固醇流出 為了觀察GPR120激活是否能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞膽固醇流出，我們用50～200 μmol/L的GPR120激動(dòng)劑GW9508處理負(fù)載NBDTC的RAW264.7細(xì)胞，經(jīng)分析NBD-TC的流出率后發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組（0μmol/L GW9508）相比，100、150和200μmol/L的GW9508均可以促進(jìn)NBD-TC向細(xì)胞外apo-A1和HDL-C的流出，且呈劑量依賴性；NBDTC流出率分別增加了8%、10%及18%（圖1）。

圖1 50-200μmol/L的GW9508對(duì)RAW264.7細(xì)胞膽固醇流出的影響（n=4）注：與 對(duì) 照 組（0μmol/L）相 比，*P＜0.05；**P＜0.01

2.50～200μmol/L的GW9508均不影響RAW264.7細(xì)胞的存活率 為了檢測(cè)50～200 μmol/L的GW9508是否具有細(xì)胞毒性，我們用GW9508處理RAW264.7細(xì)胞18h后，用MTS方法檢測(cè)了細(xì)胞存活率，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組（0μmol/L GW9508）相比，50、100、150和200μmol/L的GW9508均不改變細(xì)胞的存活率（圖2）。因此，50、100、150和200μmol/L的GW9508均無(wú)細(xì)胞毒性。

圖2 GW9508對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響（n=5）

3.GPR120激動(dòng)劑GW9508提高RAW264.7細(xì)胞ABCA1、ABCG1的表達(dá) ABCA1、ABCG1和SRB1是巨噬細(xì)胞膽固醇流出的主要轉(zhuǎn)運(yùn)體。為了探討GPR120是如何促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞膽固醇流出的，我們用100及200μmol/L的GW9508處理細(xì)胞18h后，定量PCR方法檢測(cè)了細(xì)胞ABCA1、ABCG1和SR-B1的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組（0μmol/L GW9508）相比，100及200μmol/L的GW9 508分別升高了ABCA1的mRNA水平3.6倍和6.8倍，分別升高了ABCG1的mRNA水平1.6倍和3.3倍，但沒(méi)有改變SR-B1的mRNA水平（圖3A）。

同時(shí)，我們用50～200μmol/L的GW9508處理RAW264.7細(xì)胞18h后，Western blot方法檢測(cè)了ABCA1、ABCG1和SR-B1的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組（0μmol/L GW9508）相比，GW9508可以升高ABCA1和ABCG1的蛋白表達(dá)水平且呈劑量依賴性；100、150及200μmol/L的GW9 508分別上調(diào)了ABCA1的蛋白水平1.4倍、1.8倍和4.8倍，分別上調(diào)了ABCG1的蛋白水平1.3倍，3.2倍和5.1倍。然而，50～200μmol/L的GW9508均不影響SR-B1的蛋白表達(dá)水平（圖3B～C）。

4.GPR120激動(dòng)劑GW9508提高RAW264.7細(xì)胞LXRα的表達(dá)水平 肝X受體（Liver X receptors，LXRs）和過(guò)氧化體增殖物激活受體（Peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs）都可以參與ABCA1和ABCG1的表達(dá)調(diào)控，為了確定是否它們?cè)贕W9508誘導(dǎo)的Raw264.7細(xì)胞ABCA1和ABCG1表達(dá)中也起調(diào)控作用，我們用定量PCR的方法檢測(cè)了它們的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)：100和200μmol/L的GW9508均可上調(diào)Raw264.7細(xì)胞LXRα的mRNA水平，分別上調(diào)了0.6倍和1.25倍，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但不影響LXRβ、PPARα和PPARγ的mRNA水平（圖4）。

圖3 GW9508對(duì)Raw264.7細(xì)胞的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)體ABCA1、ABCG1和SR-B1表達(dá)水平的影響（n=3） A：實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)ABCA1、ABCG1和SR-B1的mRNA表達(dá)水平；B：Western blot檢測(cè)ABCA1、ABCG1和SR-B1蛋白表達(dá)水平；C：相關(guān)蛋白的統(tǒng)計(jì)結(jié)果；注：與對(duì)照組（GW9508 0μmol/L）相比，*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001

圖4 GW9508對(duì)Raw264.7細(xì)胞的LXRs和PPARs的mRNA水平的影響（n=3）。注：與對(duì)照組（GW9508 0μmol/L）相比，*P＜0.05

討 論

動(dòng)脈內(nèi)皮下的巨噬細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)體（ABCA1、ABCG1和SR-B1）將細(xì)胞內(nèi)過(guò)剩的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外apoA1和HDL-C上，這個(gè)過(guò)程稱為膽固醇流出；它是膽固醇反向轉(zhuǎn)運(yùn)的第一步，也是關(guān)鍵步驟[1，3]。在巨噬細(xì)胞，ABCA1經(jīng)水解ATP獲得能量后，將細(xì)胞內(nèi)的游離膽固醇和磷脂經(jīng)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外乏脂的apoA-1上，形成新生的高密度脂蛋白（nHDL），起始了HDL的形成和巨噬細(xì)胞膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)。ABCG1的主要功能是將細(xì)胞內(nèi)的游離膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外成熟的HDL顆粒上[8]。另外，表達(dá)于巨噬細(xì)胞的清道夫受體SR-B1也可以介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的膽固醇流向細(xì)胞外的HDL顆粒[9-10]。

GPR120是脂肪酸受體家族成員，在巨噬細(xì)胞中高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)：與配體結(jié)合的GPR120通過(guò)激活與其偶聯(lián)的G蛋白的α亞基Gαq，介導(dǎo)以下生理功能：刺激腸道分泌胰高血糖素樣肽-1（Glucagonlike peptide 1，GLP-1），增強(qiáng)胰島β細(xì)胞分泌胰島素，提高脂肪、肝臟和骨骼肌組織對(duì)胰島素的敏感性；調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化、脂肪組織抗炎、以及棕色脂肪的能量代謝等[6，11-13]。另外，激活的GPR120也可以通過(guò)β-抑制蛋白（arrestin）2拮抗細(xì)菌脂多糖和TNFα等誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥，促進(jìn)巨噬細(xì)胞由M1型向M2型的轉(zhuǎn)化[7]。在本研究中，我們首次發(fā)現(xiàn)：激活RAW264.7巨噬細(xì)胞的GPR120可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的膽固醇向細(xì)胞外流出，這一功能是通過(guò)上調(diào)ABCA1和ABCG1的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的，而與SR-B1無(wú)關(guān)。

多種因素在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平嚴(yán)密調(diào)控ABCA1和G1的表達(dá)。其中核受體家族成員LXRs及PPARs在ABCA1和G1的表達(dá)調(diào)控中其重要作用；LXR（α和β）是配體激活的核受體，LXRα高表達(dá)于巨噬細(xì)胞、肝臟和小腸等脂代謝活躍的組織器官，而LXRβ在全身廣泛表達(dá)。在巨噬細(xì)胞，激活的LXR與視黃醛X受體（retinoid X receptor，RXR）形成異源二聚體，可激活其靶基因ABCA1和G1的轉(zhuǎn)錄[14]。激活的PPARα和PPARγ也分別可與RXR結(jié)合，既能直接激活A(yù)BCA1和G1的轉(zhuǎn)錄；也能通過(guò)激活LXRα，間接上調(diào)ABCA1和G1的轉(zhuǎn)錄[15]。我們研究的發(fā)現(xiàn)：GPR120激動(dòng)劑GW9508可以上調(diào)Raw264.7巨噬細(xì)胞LXRα的mRNA表達(dá)水平，但不影響LXRβ、PPARα和PPARγ的mRNA表達(dá)水平；由此說(shuō)明：GPR120上調(diào)Raw264.7巨噬細(xì)胞ABCA1和ABCG1的表達(dá)可能是通過(guò)激活LXRα來(lái)完成的。具體GPR120是如何激活LXRα的，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)。

綜上所述，我們的研究證實(shí)了：在巨噬細(xì)胞中，激活的GPR120可以通過(guò)LXRα通路上調(diào)ABCA1和ABCG1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇向細(xì)胞外apoA-1和HDL流出。本研究為動(dòng)脈粥樣硬化的防治提供了新的思路。