鹿 堯，姚 磊，代翠紅，李新玲，張延明

(1.東北農業(yè)大學國家大豆工程技術研究中心，哈爾濱 150028；黑龍江省綠色食品科學研究院，哈爾濱 150028；2.哈爾濱工業(yè)大學化工與化學學院，黑龍江 哈爾濱 150086；3.哈爾濱師范大學生命科學與技術學院，黑龍江 哈爾濱 150020)

0 前言

葉用甜菜通過絲綢之路傳入我國，早已在我國南方及中原地區(qū)種植。植株生長前期葉片嫩時可以作為蔬菜食用，生長后期葉片或莖稈可作為家禽或家畜飼料。甜菜色素最早在食用甜菜根中被發(fā)現(xiàn)而得名[1]。甜菜色素又包括甜菜紅素和甜菜黃素[2]。甜菜紅素是一種水溶性天然色素，具有良好的著色性能，可用于食品，飲料著色等[3]。甜菜紅色素在制藥方面經常被添加進兒童服用的藥品中或者為了藥品便于區(qū)分而被加入藥中[4]。因甜菜紅素具有抗癌與抗氧化性在我國已開展了抗癌性藥物的研發(fā)，并且我國科研人員通過探討甜菜紅色素對小鼠抗輻射的保護作用及機制發(fā)現(xiàn)了紅色素的抗輻射功能[5]。甜菜紅素的生物合成途徑主要有兩條：一是由環(huán)多巴甜菜醛氨酸的糖基化衍生而來的，另一條途徑是由閉環(huán)多巴先進行糖基化再與甜菜醛氨酸縮合[3,6]。在此合成途徑中含有三種關鍵酶酪氨酸酶、葡糖基轉移酶和4，5-DOPA-雙加氧酶[7,8,9]。酪氨酸酶可以精確的調控紅色素的形成，可以精確到時間甚至組織，目前除在甜菜中鑒定出，還在鹽地堿蓬中也被鑒定出[10]。葡糖基轉移酶也是紅色素合成過程中不可缺少的酶，其與色素的形成具有相關性[11]。4，5-DOPA-雙加氧酶是甜菜紅色素合成途徑末端的關鍵酶，研究表明該酶的酶活與甜菜積累的量呈正相關[12]。本實驗研究與甜菜紅色素合成密切相關的基因表達量在不同時期的變化來探究甜菜紅素合成代謝分子機理。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 甜菜材料

食用紅甜菜，由哈爾濱工業(yè)大學自育的食用甜菜品種工大食甜1號。

1.1.2 主要試劑與儀器設備

Trizol購自美國英杰生命技術有限公司；氯仿、異丙醇、無水乙醇購自天津市永大化學試劑有限公司；DNA酶購自普洛麥格生物技術有限公司；西班牙瓊脂糖購自北京沃比森科技有限公司；TAE購自北京索萊寶科技有限公司；EB 購自西格瑪公司；反轉錄試劑盒和熒光定量預混液購自Applied Biosystems?ABI；檢測引物由華大基因合成；DL2000 Marker購自日本Takara公司。

電子分析天平(BSA223S)購自賽多利斯(北京)科學儀器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9052)購自上海益恒科學儀器有限公司；高速冷凍離心機(D-37520)購自德國Heraeus公司；低速離心機(TGL-16G)購自上海安亭科學儀器廠；微波爐MM721AAU-PW(X)購自美的微波爐電器制造有限公司；電泳儀電源(DYY-6C)購自北京六一儀器廠；Super Clean Bench(SW-CJ-2FD)購自蘇州安泰空氣技術有限公司；微型電泳槽(DYCP-31BN)購自北京六一儀器廠；基因擴增儀(Hema3200)購自珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司；熒光定量PCR儀(CFX96)購自美國伯樂BIO-RAD；可見紫外分光光度計(WFZ UV-2100)購自尤尼柯(上海)儀器有限公司；Micro Drop 分光光度計(Bio-dl)購自上海寶予得科學儀器有限公司；超聲儀(SD-5200D)購自寧波新芝生物科技股份有限公司；4℃/-20℃冰箱(BCD-160TMPQ)購自青島海爾特種電器有限公司；滅菌鍋(SXQ-DSX-280B)購自上海中安醫(yī)療器械廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 食用紅甜菜品種及播種：

品種：工大食甜1號。

播種：4月25日播種，種植地為哈爾濱工業(yè)大學學府校區(qū)試驗地。前茬大豆，秋起壟，秋施底肥二氨為225 kg/ha，種肥二氨為180 kg/ha。疏苗1次，定苗1次，三產三趟。防蟲害防除根據(jù)實際發(fā)生情況防除2次。

1.2.2 取樣及凍存

本實驗所用的甜菜樣品從長出第二對真葉開始取樣，每增加1對真葉取樣1次，至第7對真葉共計取6次； 7對真葉期后；所有后續(xù)樣品每半個月取一次樣，取樣3次。共計9個樣品。每次取樣后將清洗干凈的紅甜菜葉樣品用袋子密封后放入-20℃冰箱中保存?zhèn)溆肹13]。

1.2.3 總RNA的提取

本實驗采取Trizol法提取總RNA，具體步驟參照說明書。

1.2.4 RNA濃度測定

使用Micro Drop分光光度計進行測量，樣品測量前先進行空白校正，用移液槍取2 μL純水置于下光纖頭上，校正基線。隨后依次測量提取的樣品，吸取1 μL混勻的樣品，槍頭貼著下光纖表面打出樣品，在260 nm和280 nm紫外光波長下，測定該樣品的光密度值，記錄檢測數(shù)據(jù)。

1.2.5 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量

制備2%瓊脂糖凝膠，稱取0.4 g瓊脂糖置于錐形瓶中，加入20 mL 1×TAE，在微波爐中加熱煮沸3次至瓊脂糖全部融化，搖勻，冷卻至60℃，加入1 μL EB倒入制膠槽內。室溫下靜置直至凝膠完全凝固，垂直輕拔梳子，將凝膠及內槽放入電泳槽中。添加1×TAE電泳緩沖液至沒過膠板為止。取1 μL總RNA與0.5 μL上樣緩沖液吸打混勻，點入點樣孔。蓋好電泳槽蓋，接通電泳儀電源與電泳儀之間的電泳導線，設定電壓為120 V，電泳時間約為30 min，直至溴酚藍指示帶接近分離膠底部，切斷電源，電泳完畢。在紫外透射儀中觀察結果。

1.2.6 RNA的反轉錄

使用羅氏反轉錄試劑盒反應體系，具體操作如下；

(1)使用前將所有冷凍試劑解凍，開始試驗前將所有試劑輕度離心，實驗開始后保持所有試劑置于冰上。

(2)將無菌、無核酸酶、薄管壁的PCR管置于冰上，以20 μL反應體系為例，按表1準備模板-引物混合物。

表1 反轉錄反應液的配制

(3)在反應管中將試劑小心混勻。注意：不要渦旋！將反應管輕度離心使樣本收集于反應管底部。反應時使用帶熱蓋的加熱模塊，防止反應管中的液體揮發(fā)。

(4)按照表2設置反應條件

表2 反轉錄反應條件

將反應管放入基因擴增儀中，按設定好的程序運行。

1.2.7 熒光定量PCR

將反轉錄后的cDNA稀釋2倍，作為模板，然后按表3組份，在冰上配制PCR反應液。將上述混合液反復吸打混勻后加入八連管，小心蓋上透明蓋，避免指紋粘上需更換新的塑料手套。使用低速離心機短時間離心后將八連管放入實時定量PCR儀中，按照設定好的程序運行。

表3 熒光定量反應液的配制

1.2.8 瓊脂糖凝膠電泳檢測熒光定量產物

取熒光定量PCR產物5 μL，混合1 μL的上樣緩沖液，制備瓊脂糖凝膠，濃度1%。按照瓊脂糖凝膠電泳的操作方法進行電泳實驗，然后在紫光燈下檢測電泳結果并拍照。

1.3 甜菜紅素合成相關基因特異性引物的設計

查閱文獻發(fā)現(xiàn)與甜菜紅色素生物合成途徑中，主要有三個基因參與紅色素的合成：酪氨酸酶基因、葡糖基轉移酶基因和4,5-DOPA-雙加氧酶基因[14]。在甜菜cDNA文庫中進行BLAST比對，找到對應的基因序列，交由華大基因公司設計并合成熒光定量基因檢測引物。本實驗所用的特異性引物序列如表4所示。

表4 甜菜紅色素合成相關基因引物的序列設計

引物合成后，用離心機12 000 rpm離心10 min，在超凈工作臺中打開稀釋。用 DEPC處理后高壓滅菌過的水按說明書稀釋成濃度為100 pmol/μL的母液備用，-20℃保存?zhèn)溆?。從稀釋過的引物中再抽取50 μL加450 μL DEPC處理過的H2O稀釋成10 pmol/μL用于實驗。

2 結果與分析

2.1 不同時期食用紅甜菜葉片總RNA的提取

在Trizol法提取RNA的基本操作中，添加了DNA酶處理及氯仿再次抽提的步驟，這可以使提取出來的RNA中基因組DNA及蛋白質的含量降低很多，進而保證提取出來RNA樣品的質量。RNA樣品電泳后得到瓊脂糖凝膠電泳圖，如圖1所示。

圖1 紅甜菜不同時期葉片的總RNA電泳圖

由圖1(a)(b)可知，紅甜菜葉片所提取的大部分樣品RNA都沒有降解，18S和28S條帶清晰、整齊可見，樣品的RNA完整性均很好，因此九個樣品的RNA都可以用于后續(xù)反轉錄實驗。

2.2 RNA濃度和純度的檢測分析

取1 μl DEPC處理過的水作為空白對照，后將所提取全部RNA各取1 μl點樣在下光纖表面，用Micro Drop 分光光度計檢測在260 nm和280 nm紫外光波長下，測定該樣品的濃度和純度，記錄檢測數(shù)據(jù)。

由表5可知所有樣品的純度均很高，很多樣品260/280的比值非常接近于2.0。同時，由前文所列的電泳圖也可看出所有樣品的RNA的完整性較高，因此這些RNA樣品均可用于后續(xù)實驗。

表5 所有樣品RNA濃度及純度測定

2.3 RNA的反轉錄及轉錄后產物稀釋

將提取后的RNA根據(jù)測定的初始濃度進行統(tǒng)一調整，分別加DEPC處理后的水，將所有RNA樣品濃度調整至500 μg/mL，以便在后續(xù)反轉錄實驗中便于計算和加樣。將9個 RNA樣本按照cDNA反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄。然后隨機取一個樣品進行電泳檢測，由電泳圖可知，2號泳道中出現(xiàn)彌散的條帶，這是由長度不同的cDNA構成，說明反轉錄成功。

圖2 反轉錄樣品的電泳檢測

隨機選取其中的兩個cDNA產物原液，用內參基因ICDH初步檢測一下其熒光定量效果，初步檢測其Ct為22左右，由于Ct值不是很高，所以在做熒光定量時只把cDNA做了2倍稀釋，用于熒光定量的cDNA模版。

2.4 葉片不同時期三種基因的表達情況

2.4.1 酪氨酸酶基因的表達

以同品系紅甜菜不同生長時期的葉片作為研究對象，將9個時期的樣品進行了qRT-PCR檢測，以ICDH基因為內參基因，對三個基因進行相對表達量的分析，最終結果分別如圖3、4、5所示。

注：1.二對真葉期 2.三對真葉期 3.四對真葉期 4.五對真葉期 5.六對真葉期 6.七對真葉期 7.七號樣品(7月11日采樣) 8.八號樣品(8月8日采樣) 9.九號樣品(8月22日采樣)圖3 酪氨酸酶基因在甜菜不同生長期表達差異分析

由圖3可見，在九個取樣時期，前三個時期(即從二對真葉期到四對真葉期)，酪氨酸酶基因的表達一直處于上升趨勢，并在四對真葉期時相對表達量達到頂峰，相對表達量達到2.5，之后的6個時期，酪氨酸酶基因的表達量呈現(xiàn)出明顯的下降態(tài)勢，并在七對真葉期以后表達量顯著下降，都低于0.5；由此分析葉片中的酪氨酸酶基因主要在食用紅甜菜的生長早期(五對真葉期以前)有較高的表達。但是否對色素合成油作用尚不明確。

2.4.2 葡糖基轉移酶基因的表達

由圖4可見，在九個取樣時期，葡糖基轉移酶基因均有不同程度的表達，在三對真葉期出現(xiàn)了相對表達量高峰，表達量達到近2.5，但在第四對真葉期葡糖基轉移酶急劇下降，約為前一個時期的1/5，此后逐漸回升，在第六次取樣時又達到一個小高峰。此后在下降。在調查的9個取樣期間內，除食用紅甜菜第3對真葉期葡糖基轉移酶基因表達量明顯提高外，其他幾個時期相對表達量之間雖有變化但不明顯。

注：1.二對真葉期 2.三對真葉期 3.四對真葉期 4.五對真葉期 5.六對真葉期 6.七對真葉期 7.七號樣品(7月11日采樣) 8.八號樣品(8月8日采樣) 9.九號樣品(8月22日采樣)圖4 葡糖基轉移酶基因在甜菜不同生長期表達差異分析

2.4.3 4,5-DOPA-雙加氧酶基因的表達

由圖5可見，在九個取樣時期，前6個時期(七對真葉期以前)4,5-DOPA-雙加氧酶基因均有不同程度的表達，在三對真葉期時表達量最高，達到15.6，而其它幾個真葉期表達量雖不如三對真葉期那么高，但平均表達量也都在1左右；相比之下在取樣的后3個時期幾乎不表達，這說明4,5-DOPA-雙加氧酶基因主要在甜菜的真葉生長期起作用，在食用甜菜的生長中后期幾乎不起作用。該基因對調控紅色素的合成的作用在次試驗中不明確。

注：1.二對真葉期 2.三對真葉期 3.四對真葉期 4.五對真葉期 5.六對真葉期 6.七對真葉期 7.七號樣品(7月11日采樣) 8.八號樣品(8月8日采樣) 9.九號樣品(8月22日采樣)圖5 4,5-DOPA-雙加氧酶基因在甜菜不同生長期表達差異分析

3 結果與討論

本實驗對食用紅甜菜9個不同生長期的酪氨酸酶基因、葡萄糖基轉移酶基因和4，5-DOPA-雙加氧酶基因相對表達量進行了分析，實驗結果表明：基因在不同時期的相對表達量有一定的差異，但在三對真葉期是這三個基因相對表達量都顯著較高的時期。酪氨酸酶基因在五對真葉期以前相對表達量較高，說明其可能在早期在甜菜葉片中起著某種作用，五對真葉期以后，其表達量有明顯下降，說明其作用在減弱。葡糖基轉移酶基因在甜菜生長的各個時期都發(fā)揮著作用，但其第3對真葉期作用最大。4，5-DOPA-雙加氧酶基因在食用紅甜菜葉片生長后期基本不表達，所以推測其對甜菜塊根中紅色素的累積沒有什么作用。

本研究只探討了紅甜菜葉片中，紅色素合成相關基因的表達情況，要想透徹了解紅甜菜中紅色素積累與紅色素合成相關基因之間的關系，還應結合不同組織部位如葉柄、根部中的基因表達情況進行進一步的研究分析。