唐 朝 孟芳 鄧漢生

舒更葡糖鈉為特異性結(jié)合性神經(jīng)肌肉阻滯拮抗藥物[1]。其是一種經(jīng)修飾的γ-環(huán)糊精，通過與神經(jīng)肌肉阻滯藥物羅庫溴銨或維庫溴銨在血漿中形成復(fù)合物，進(jìn)而降低在神經(jīng)肌肉接頭處與煙堿受體相結(jié)合的神經(jīng)肌肉阻滯藥物的數(shù)量，由此拮抗由羅庫溴銨或維庫溴銨誘導(dǎo)的神經(jīng)肌肉阻滯[2-3]。

本研究采用等溫滴定量熱法（ITC）[4-5]和高效液相色譜法（HPLC）[6]開展不同廠家舒更葡糖鈉注射液與羅庫溴銨的體外結(jié)合及其釋放行為研究，評價不同廠家舒更葡糖鈉注射液與羅庫溴銨結(jié)合及釋放特征，以期為臨床合理用藥提供參考和依據(jù)。

1 儀器、試劑與方法

1.1 儀器、試劑

儀器：MicroCal PEAQ-ITC等溫滴定量熱儀（Malvern），1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀（Agilent）。

試劑：舒更葡糖鈉注射液（含量：100 mg/ml，批號：U035232，布瑞亭，A制劑，默沙東(中國)投資有限公司），舒更葡糖鈉注射液（含量：100 mg/ml，仿制藥，B制劑，揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司），羅庫溴銨對照品（含量：＞98%，大連博格林生物科技有限公司），羅庫溴銨注射液（含量：10 mg/ml，浙江仙琚制藥股份有限公司），四甲基氫氧化銨（分析純，上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司），乙腈（≥99.9%，西格瑪奧德里奇（上海）有限公司），磷酸（分析純），實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 ITC測定羅庫溴銨的結(jié)合常數(shù)

1.2.1.1 受試化合物溶液的制備室溫條件下受試化合物溶液的制備：用超純水稀釋舒更葡糖鈉注射液及羅庫溴銨注射液，分別配制舒更葡糖鈉最終濃度為0.1 mmol/L，羅庫溴銨為1.0 mmol/L。高溫條件下受試化合物溶液的制備：將舒更葡糖鈉注射液置于60 ℃條件下10 d后進(jìn)行測定，用超純水分別稀釋舒更葡糖鈉注射液及羅庫溴銨注射液，分別配制舒更葡糖鈉最終濃度為0.1 mmol/L，羅庫溴銨為1.0 mmol/L。光照條件下受試化合物溶液的制備：將舒更葡糖鈉注射液置于4 500 Lx，25 ℃，60%相對濕度（RH）條件下放置10 d后進(jìn)行測定，用超純水稀釋舒更葡糖鈉注射液及羅庫溴銨注射液，分別配制舒更葡糖鈉最終濃度為0.1 mmol/L，羅庫溴銨為1.0 mmol/L。1%血清白蛋白（BSA）受試化合物溶液的制備：用含1%BSA的超純水溶液稀釋舒更葡糖鈉注射液及羅庫溴銨注射液，配制舒更葡糖鈉最終濃度為0.1 mmol/L，羅庫溴銨為1.0 mmol/L。

1.2.1.2 樣品測定樣品池注入280 μl待滴定的舒更葡糖鈉溶液，40 μl羅庫溴銨溶液裝入注射器，恒溫至25 ℃，控制攪拌速率為750 r/min，待儀器自動平衡后，記錄60 s后開始滴定，連續(xù)滴定19滴，首滴0.4 μl，后18滴2 μl，間隔時間為150 s。

1.2.2 羅庫溴銨HPLC的建立色譜柱：C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動相：乙腈-4.53 g/L四甲基氫氧化銨溶液（體積比為90∶10，用磷酸調(diào)節(jié)pH至7.4）；檢測波長：210 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μl。

1.2.3 羅庫溴銨與不同廠家舒更葡糖的結(jié)合速率評價5 ml 2.0 mg/ml的羅庫溴銨溶液分別與不同廠家5 ml 6.6 mg/ml舒更葡糖鈉溶液混合均勻后37 ℃孵育，分別在10 min、20 min、30 min時用1 000 Da超濾管超濾分離游離藥物。過濾樣品溶液采用HPLC測定游離羅庫溴銨的濃度，根據(jù)游離藥物與加入藥物的濃度計(jì)算藥物結(jié)合率。

1.2.4 羅庫溴銨與不同廠家舒更葡糖結(jié)合后的釋放行為評價1 ml 10.0 mg/ml羅庫溴銨溶液與1 ml 33.3 mg/ml舒更葡糖鈉溶液在37 ℃混合孵育20 min后，將其分別置于100 ml 磷酸鹽緩沖液（PBS）和100 ml含有1%BSA的PBS中（37 ℃搖床，75轉(zhuǎn)/min），分別在5 min、10 min、20 min、30 min時取液2 ml（取液后立即補(bǔ)液2 ml），立即用超濾管（1 000 Da）高速離心。過濾液采用HPLC測定釋放的游離羅庫溴銨濃度。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理采用MicroCal PEAQ-ITC Analysis Software軟件中one binding site model對每組滴定數(shù)據(jù)分別進(jìn)行擬合，得到每組滴定反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)及相關(guān)熱力學(xué)常數(shù)。數(shù)據(jù)分析和比較采用GraphPad Prism 8（GraphPad Software Inc.，La Jolla，CA，USA）和Excel軟件。兩組之間的統(tǒng)計(jì)比較采用雙尾Studentt檢驗(yàn)。多個（兩個以上）組之間的統(tǒng)計(jì)比較采用單因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 舒更葡糖鈉與羅庫溴銨結(jié)合的ITC結(jié)果

表1結(jié)果表明，舒更葡糖鈉與羅庫溴銨具有極強(qiáng)的藥物結(jié)合能力，其結(jié)合常數(shù)KD均小于10-5mol/L。在常溫條件下，B制劑的舒更葡糖鈉KD值顯著高于A制劑（P＜0.05）。光照與高溫條件對各制劑與羅庫溴銨的結(jié)合常數(shù)KD值未有顯著影響（P＞0.05）。加入1%BSA后，B制劑的KD值高于A制劑，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），各制劑的KD值均顯著增大（P＜0.05），提示在血清存在條件下，羅庫溴銨可能和血清蛋白存在競爭性結(jié)合舒更葡糖鈉。

表1 舒更葡糖鈉和羅庫溴銨結(jié)合相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)(n=6)

2.2 羅庫溴銨與不同廠家舒更葡糖鈉的結(jié)合率與結(jié)合速率

羅庫溴銨與不同廠家舒更葡糖鈉的結(jié)合率結(jié)果如圖1～2所示。羅庫溴銨與不同廠家舒更葡糖鈉的結(jié)合率結(jié)果表明：舒更葡糖與羅庫溴銨以近似1∶1的分子比例（質(zhì)量比1∶3.3）結(jié)合，且超濾可將游離羅庫溴銨與舒更葡糖羅庫溴銨結(jié)合物有效分離。在10 min時大部分羅庫溴銨與舒更葡糖快速結(jié)合，在20 min已基本全部結(jié)合。B制劑在5 min時的結(jié)合率和結(jié)合速率均顯著低于A制劑（P＜0.05）。

圖1 羅庫溴銨與不同廠家舒更葡糖鈉的結(jié)合速率(n=6)

圖2 羅庫溴銨與不同廠家舒更葡糖鈉混合5 min時的結(jié)合速率比較(n=6)

2.3 羅庫溴銨與不同廠家舒更葡糖結(jié)合后的釋放行為

羅庫溴銨與不同廠家舒更葡糖結(jié)合后的釋放結(jié)果表明：羅庫溴銨與舒更葡糖結(jié)合物在PBS（pH 7.4）釋放介質(zhì)中各時間點(diǎn)均未測到游離的羅庫溴銨，表明羅庫溴銨與舒更葡糖均能以結(jié)合物的形式存在，結(jié)合物穩(wěn)定性較強(qiáng)。當(dāng)釋放介質(zhì)中存在BSA時，僅B制劑在5 min時測得極少量游離藥物釋放，而在其他時間點(diǎn)和A制劑各時間點(diǎn)均未測到游離藥物。

3 討論

本研究采用ITC測定了舒更葡糖鈉與羅庫溴銨的結(jié)合力，該方法靈敏度高，專屬性較好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也確證舒更葡糖鈉與羅庫溴銨的結(jié)合常數(shù)KD均小于10-5mol/L，呈現(xiàn)出極強(qiáng)的羅庫溴銨結(jié)合能力。兩個廠家的舒更葡糖鈉制劑與羅庫溴銨結(jié)合力具有一定的差異性，其中與A制劑（原研藥）的KD值相比B制劑顯著降低，約為原研藥的58%，提示其體內(nèi)拮抗羅庫溴銨的能力可能弱于A制劑。加入1%BSA后，羅庫溴銨的KD值與正常條件下相比均顯著增大，提示在血清存在條件下，羅庫溴銨可能和血清蛋白存在競爭性結(jié)合舒更葡糖。

羅庫溴銨與舒更葡糖鈉結(jié)合與釋放行為的評價結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了羅庫溴銨與舒更葡糖鈉具有極強(qiáng)的結(jié)合力[7]，在PBS（pH7.4）釋放介質(zhì)中均能以藥物-環(huán)糊精結(jié)合物的形式存在，并且結(jié)合物的穩(wěn)定性較好[8]，而當(dāng)釋放介質(zhì)中存在BSA時，僅發(fā)現(xiàn)B制劑在早期時（5 min）有極少游離藥物釋放，而A制劑未測到游離藥物，提示在血清競爭性結(jié)合下可能導(dǎo)致弱結(jié)合藥物從環(huán)糊精上快速釋放。據(jù)該藥品說明書，舒更葡糖鈉注射液中含有單-羥基舒更葡糖，而單-羥基舒更葡糖與羅庫溴銨和維庫溴銨之間的親和力約為舒更葡糖的50%。因此，引起不同廠家舒葡糖鈉與羅庫溴銨結(jié)合力和早期釋放特性差異的原因可能是不同制劑中單-羥基舒更葡糖含量存在差異。