劉宏飛，陳曉紅，黃志剛*，高 苒

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院，北京 100730；2. 國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京 100021；3. 北京市人類重大疾病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型工程技術(shù)研究中心，北京 100021)

近年來(lái)，雖然腫瘤治療領(lǐng)域不斷取得實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展，但腫瘤仍然是威脅人類健康的主要問(wèn)題之一。目前減少腫瘤死亡率的手段主要有倆種，一是早期發(fā)現(xiàn)，二是開發(fā)新型有效的治療手段。其中開發(fā)新型治療手段的主要障礙之一是如何將科學(xué)成果轉(zhuǎn)化到臨床應(yīng)用。目前腫瘤研究中最常用的模型仍然是腫瘤細(xì)胞系(patient-derived cancer cell lines, PDC)。然而由于其在培養(yǎng)過(guò)程中大量丟失腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性，不能完整重現(xiàn)患者腫瘤特征，導(dǎo)致很多藥物雖然在前期PDC中實(shí)驗(yàn)效果良好，但在后續(xù)的人體實(shí)驗(yàn)中卻被證實(shí)無(wú)效。因此，為了推動(dòng)腫瘤臨床和基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的發(fā)展，近年來(lái)，研究者們一直致力于開發(fā)能夠真實(shí)反映患者腫瘤特征的試驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｆ渲?，最具代表性的兩類為人源性類器?patient-derived organoids,PDOs)和人源性腫瘤組織異種移植(patient-derived xenografts,PDXs)模型。

表1 腫瘤細(xì)胞系、類器官和PDX模型的特點(diǎn)

注：最合適(+++);合適 (++);可以實(shí)現(xiàn) (+);不太合適(±);不合適(-)。

Note. Most suitable(+++),suitable(++),possible(+),not very suitable(±);unsuitable(-).

PDOs是經(jīng)過(guò)體外三維(3D)培養(yǎng)構(gòu)建的多細(xì)胞團(tuán)，具有自我更新和自我組裝能力，保留了原始組織的生理結(jié)構(gòu)和功能，在體外培養(yǎng)條件下能夠無(wú)限增殖。PDX模型是將患者來(lái)源的腫瘤組織直接移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)。由于未經(jīng)過(guò)任何體外培養(yǎng)過(guò)程，因此能在很大程度上保持腫瘤異質(zhì)性。

以上三種研究模型各有優(yōu)缺點(diǎn)(表1)，對(duì)于腫瘤的研究有著十分重要的意義。本文將著重概述PDOs和PDXs模型在腫瘤臨床前研究和基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用情況。

1 3D類器官

目前，已經(jīng)能夠成功建立多種具有關(guān)鍵生理結(jié)構(gòu)的類器官，包括結(jié)腸[1]、肝[2]、食道[3]、肺[4]、和乳房[5]等。下面將著重介紹成人干細(xì)胞來(lái)源的類器官技術(shù)在腫瘤的臨床前研究和基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用。

1.1 臨床前研究

1.1.1 類器官模型庫(kù)

近年來(lái)，國(guó)外建立了很多大規(guī)模的PDOs生物庫(kù)，主要用于評(píng)估類器官在預(yù)測(cè)個(gè)性化藥物反應(yīng)中的應(yīng)用價(jià)值。Fujii等[6]建立了55名CRCs患者來(lái)源的腫瘤組織類器官庫(kù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)建立不同亞型CRCs患者的類器官，所需培養(yǎng)基不同。例如，一些患者的類器官必須在缺乏p38 MAPK或低氧的培養(yǎng)基中進(jìn)行；另外，腫瘤的突變背景不同，所需培養(yǎng)基成分不同。然而，一般情況下，在培養(yǎng)新鮮PDOs時(shí)，腫瘤的遺傳背景尚不能確定，因此需要將不同的生長(zhǎng)因子進(jìn)行不同組合，提高培養(yǎng)成功率。研究還發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織類器官不僅保留了原始腫瘤組織的病理學(xué)特征，還能夠在免疫缺陷小鼠的腎包膜下進(jìn)行異種移植。已有研究者同時(shí)建立了CRCs的PDXs和PDOs生物庫(kù)，用于探尋能夠預(yù)測(cè)EGFR抑制劑療效的生物標(biāo)記物[7]?？傊陨涎芯烤C明腫瘤類器官生物庫(kù)適宜進(jìn)行藥物篩選。

1.1.2 藥物開發(fā)和個(gè)體化用藥

由于PDOs模型能夠很好地保留原始腫瘤的異質(zhì)性和組織學(xué)特性，目前已成為測(cè)試新型抗癌藥物的理想模型。例如，在RAS突變的CRCs類器官中分別使用MEK抑制劑、ERK抑制劑或HER抑制劑聯(lián)合MEK抑制劑，結(jié)果顯示三種用藥方案均可有效抑制腫瘤生長(zhǎng)[8]。然而進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這些治療僅僅使類器官細(xì)胞進(jìn)入了細(xì)胞周期停滯狀態(tài)而非細(xì)胞凋亡，因此當(dāng)停止用藥時(shí)，腫瘤細(xì)胞會(huì)快速生長(zhǎng)。而當(dāng)聯(lián)合使用EGFR通路抑制劑時(shí)，可再次致敏RAS突變的CRCs細(xì)胞，為臨床治療CRCs患者提供了新的選擇。

由于類器官既可來(lái)源于腫瘤組織，又可來(lái)源于正常成體組織。因此在應(yīng)用于藥物開發(fā)時(shí)，能夠利用類器官篩選出特異性針對(duì)腫瘤細(xì)胞而不損傷正常細(xì)胞的藥物。藥物誘導(dǎo)肝毒性一般是由細(xì)胞色素P450酶介導(dǎo)，而肝臟類器官在誘導(dǎo)分化過(guò)程中，可表達(dá)接近于生理水平的細(xì)胞色素P450酶[2, 9]，因此在臨床前試驗(yàn)中使用肝臟類器官測(cè)試藥物肝毒性是十分必要的。同樣，iPSC衍生的心臟類器官可用于測(cè)試藥物的心臟毒性[10]；iPSC衍生的腎類器官可用于腎毒理學(xué)研究[11]。

囊性纖維化(cystic fibrosis,CF)患者是由于囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)突變所致。Dekkers等人[12]利用直腸類器官測(cè)試了不同CFTR增效劑對(duì)不同患者的療效，最終確定了哪些患者將受益于特定類型的CFTR增敏劑。鑒于前期研究所取得的巨大成效，目前荷蘭已將類器官培養(yǎng)作為CF患者的常規(guī)診治流程之一。

1.1.3 免疫治療

目前，研究者已經(jīng)成功開發(fā)了免疫細(xì)胞與類器官的共培養(yǎng)體系。例如，在培養(yǎng)基中添加IL2、IL7及IL15，使上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(IEL)與小鼠的腸道類器官共存數(shù)周之久[13]。另一些研究則發(fā)現(xiàn)，與人類乳腺癌上皮類器官共培養(yǎng)的γδ2 T細(xì)胞甚至能夠有效殺傷三陰性乳腺癌細(xì)胞[14]。這些研究結(jié)果證明類器官在腫瘤免疫療法里的巨大應(yīng)用前景。最近Stronen等[15]又證實(shí)，來(lái)自健康獻(xiàn)血者的幼稚T淋巴細(xì)胞可識(shí)別新抗原，特異性殺滅表達(dá)新抗原的惡性黑色素瘤細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)證明健康供體的T細(xì)胞可能對(duì)患者的腫瘤具有細(xì)胞毒性作用。Tajima等[16]還發(fā)現(xiàn)，胸腺類器官能夠?yàn)轶w外有效擴(kuò)增腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞提供更具生理性的微環(huán)境。

1.2 基礎(chǔ)研究

1.2.1 傳染性病原體與腫瘤發(fā)生的關(guān)系

據(jù)報(bào)道，約1/5的腫瘤發(fā)生與感染因子有關(guān)[17]。然而它們導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的機(jī)制卻不甚清楚。利用類器官可以協(xié)助研究人員闡明病原體與腫瘤發(fā)生的關(guān)系。例如，利用胃類器官研究慢性幽門螺旋桿菌感染與胃癌之間的關(guān)系[9]，利用肝類器官研究肝炎病毒感染與肝癌發(fā)生的關(guān)系[18]。

1.2.2 腫瘤克隆演化

腫瘤發(fā)生是基因突變不斷累積的結(jié)果[19]。類器官有助于科研人員在研究腫瘤發(fā)展過(guò)程中，了解突變是如何出現(xiàn)和積累的。其優(yōu)點(diǎn)之一是能夠同時(shí)建立起正常組織與腫瘤組織的類器官。前者遺傳信息相對(duì)穩(wěn)定，是研究腫瘤突變信號(hào)起源的良好的對(duì)照模型[2]。Blokzijl[8]等為了探索小腸、結(jié)直腸和肝臟在發(fā)育過(guò)程的基因突變情況，利用單個(gè)干細(xì)胞培育相應(yīng)類器官。通過(guò)對(duì)不同年齡類器官進(jìn)行全基因組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，不同類型的干細(xì)胞，突變率相同；小腸、結(jié)直腸干細(xì)胞的突變類型與肝臟不同。原因是小腸和結(jié)直腸干細(xì)胞在不斷更新過(guò)程中，引起了基因特異性脫氨基突變。事實(shí)上，這也是驅(qū)動(dòng)CRCs發(fā)生的主要原因之一。總之，以上研究說(shuō)明，腫瘤的發(fā)生是特異性基因突變積累的結(jié)果，為臨床探索針對(duì)不同突變的治療方式提供了新的依據(jù)。

1.2.3 類器官的遺傳腫瘤模型

類器官能夠模擬腫瘤在特定器官中的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。其中有兩項(xiàng)研究[20-21]利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，將常見的CRCs驅(qū)動(dòng)突變組合引入健康人腸道類器官，成功建立了CRCs類器官模型。結(jié)果證明KRAS異常激活，APC、TP53、或SMAD4失活是結(jié)直腸癌的主要致病原因。后續(xù)研究將類器官移植到小鼠皮下，發(fā)展為浸潤(rùn)性腺癌，但并未發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)移，原因可能是缺乏天然腫瘤微環(huán)境。事實(shí)上，經(jīng)研究證實(shí)，將同樣的腫瘤類器官原位移植到小鼠盲腸時(shí)，成功發(fā)生了肝、肺轉(zhuǎn)移?？傊鲜鲅芯勘砻?，類器官是研究腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制的良好模型。

Sausa研究組[22]構(gòu)建了能在Lgr5+干細(xì)胞中表達(dá)白喉毒素受體的轉(zhuǎn)基因小鼠，同時(shí)加入一個(gè)能用于顯微觀察細(xì)胞的熒光蛋白。然而研究者利用白喉毒素破壞小鼠體內(nèi)的Lgr5+細(xì)胞后，卻發(fā)現(xiàn)腫瘤體積并未縮小。令人意外的是，研究人員還發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞在肝臟中的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散均受到了很大限制。這表明Lgr5+腫瘤干細(xì)胞對(duì)這一過(guò)程是不可或缺的，或許可以成為針對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在靶點(diǎn)。

2 PDX模型

PDX模型在腫瘤生物標(biāo)記物開發(fā)、藥物療效評(píng)價(jià)、高通量藥物篩選以及生物學(xué)特征研究等方面中具有重要作用。

2.1 臨床前研究

PDX模型在臨床前研究中的關(guān)鍵作用主要有倆點(diǎn):一是識(shí)別治療靶點(diǎn)，二是指導(dǎo)腫瘤患者的臨床治療[23]。目前PDX模型已經(jīng)應(yīng)用于多種腫瘤類型的臨床前藥物測(cè)試，包括非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)[24]、乳腺癌[25]和結(jié)腸癌[26]等。

2.1.1 腫瘤生物標(biāo)記物開發(fā)

PDX模型可以將臨床樣本快速擴(kuò)大。通過(guò)進(jìn)行多重組學(xué)檢測(cè)、生物信息學(xué)分析，識(shí)別不同腫瘤的診斷標(biāo)記物及藥物靶點(diǎn)[27]。如Metildi等[28]使用PDX模型發(fā)現(xiàn)熒光標(biāo)記的嵌合抗CEA抗體是診斷結(jié)腸癌的重要標(biāo)記物。Gardner等[29]建立了配對(duì)未接受化療和化療后耐藥的小細(xì)胞肺癌患者的PDX模型，發(fā)現(xiàn)EZH2通過(guò)表觀沉默SLFN11促進(jìn)耐藥發(fā)生。而使用EZH2抑制劑能夠延長(zhǎng)化療藥物的反應(yīng)時(shí)間，延緩耐藥發(fā)生。

2.1.2 評(píng)價(jià)藥物療效

PDX是藥效學(xué)評(píng)價(jià)的重要模型。CXCR4是T細(xì)胞免疫表型-急性淋巴細(xì)胞白血病(T cell immunophenotypic acute lymphoblastic leukemia T-ALL)發(fā)生的關(guān)鍵因素，與T-ALL遷移、歸巢和定位相關(guān)[30]。Pitt等[31]發(fā)現(xiàn)，以CXCR4為靶點(diǎn)的小分子拮抗劑能夠減緩T-ALL PDX模型的腫瘤生長(zhǎng)。此外，PDX模型還是臨床前檢測(cè)新型抗體的重要工具。特別是免疫檢查點(diǎn)阻斷治療(immune checkpoint blockade therapy,ICBT)，已經(jīng)在某些腫瘤患者中引起了顯著的臨床反應(yīng)。最近，Zhang等[24]利用人類造血干細(xì)胞或外周血細(xì)胞成功建立了具有人類免疫系統(tǒng)的非小細(xì)胞肺癌PDX模型，用于評(píng)估新型PD-1/PD-L1抗體療效。PDX模型還可作為評(píng)估減毒微生物的工具。有研究利用原位PDX模型證明，鼠傷寒沙門氏菌A1-R對(duì)骨肉瘤[32]、軟組織肉瘤[33]和黑色素瘤[34]具有明顯療效。Stojdl等[35]在卵巢癌的PDX模型中檢測(cè)了衰減水皰性口炎菌株AV1和AV2療效，結(jié)果對(duì)大部分接受治療的動(dòng)物均產(chǎn)生了持久的治療效果。

2.1.3 PDX生物庫(kù)和高通量藥物篩選

眾所周知，腫瘤藥物開發(fā)最主要的問(wèn)題是新藥的研發(fā)成功率低。其中一方面是由于傳統(tǒng)的臨床前模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率低[36]。另一方面是由于在研發(fā)新藥過(guò)程中沒有關(guān)注到預(yù)測(cè)生物標(biāo)記物的問(wèn)題，未能提前鑒定對(duì)治療有效的病人[37]。而PDX模型由于預(yù)測(cè)價(jià)值高，體外培養(yǎng)其腫瘤細(xì)胞即可進(jìn)行抗癌藥物的高通量篩選。目前國(guó)外已經(jīng)建立了一個(gè)大型的乳腺癌PDXs生物庫(kù)，主要用于體外高通量藥物篩選[38]。Public Repository of Xenografts (PRoXe)為公開的白血病、淋巴瘤PDXs生物庫(kù)，整合了初治和復(fù)發(fā)/難治性疾病的轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)生物標(biāo)記物。目前正在利用PRoXe生物庫(kù)進(jìn)行多種抗癌藥物的隨機(jī)II期研究[39]。

2.1.4 CAR-T治療

嵌合抗原受體T細(xì)胞(chimeric antigen receptor,CAR-T)過(guò)繼性轉(zhuǎn)移療法在腫瘤治療，特別在以CD19為靶點(diǎn)治療B細(xì)胞白血病方面展現(xiàn)了巨大的潛力[40]。Boice等人[38]利用PDX小鼠證實(shí)，丟失HVEM的B細(xì)胞，由于破壞了HVEM-BTLA的相互抑制作用，導(dǎo)致B細(xì)胞大量增殖，促進(jìn)淋巴瘤的發(fā)生。后續(xù)研究對(duì)PDX小鼠使用抗-CD19 CAR T細(xì)胞治療，發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞重新產(chǎn)生HVEM，小鼠淋巴瘤完全消退。雖然上述研究證明CAR-T治療對(duì)淋巴瘤療效顯著，但對(duì)于幾乎所有類型的實(shí)體瘤來(lái)說(shuō)，T細(xì)胞免疫療法當(dāng)前尚未取得令人滿意的結(jié)果。因此實(shí)體瘤的PDX模型可能在未來(lái)免疫治療研究中發(fā)揮重要的作用。

2.2 基礎(chǔ)研究

腫瘤基礎(chǔ)研究的目的之一是探索腫瘤的發(fā)病機(jī)制。由于PDX模型與病人原始腫瘤在基因拷貝數(shù)、基因突變和表達(dá)模式等方面具有高度一致性，因此該模型在腫瘤基礎(chǔ)研究領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛力，主要包括腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移兩個(gè)方面。

2.2.1 腫瘤發(fā)生

PDX模型在研究腫瘤細(xì)胞的起始和增殖過(guò)程中具有重要作用。例如，腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell,CSC)假說(shuō)表明腫瘤克隆僅由具有一部分具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞維持。Singh等[41]利用CD133+的人類腦腫瘤啟動(dòng)細(xì)胞(tumor initiating cells,TIC)成功誘發(fā)PDX模型的腦腫瘤發(fā)生，為CSC能夠誘發(fā)實(shí)體瘤的假說(shuō)提供了強(qiáng)有力的支持。此外,Lee等[42]利用PDX模型發(fā)現(xiàn)激活N-Myc和Akt1能夠驅(qū)動(dòng)神經(jīng)內(nèi)分泌前列腺癌的發(fā)生。

2.2.2 腫瘤轉(zhuǎn)移

轉(zhuǎn)移是腫瘤致死的基礎(chǔ)，由于發(fā)生機(jī)制尚不完全清楚，因此不能實(shí)施有效干預(yù)。PDX模型在定義細(xì)胞群與轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子中起著十分重要的作用。轉(zhuǎn)移啟動(dòng)細(xì)胞(metastasis-initiating cells,MICs)是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素[43]。在實(shí)際操作中，研究者很難從患者體內(nèi)識(shí)別、分離足夠數(shù)量的MICs進(jìn)行后續(xù)研究，然而利用PDX，研究者能夠獲得足量的MICs。Lawson等[44]使用高靈敏度的熒光激活細(xì)胞分選方法成功識(shí)別、分離了人乳腺癌PDX模型中的MICs。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells,CTCs)在腫瘤轉(zhuǎn)移中同樣起著關(guān)鍵作用，目前研究者已經(jīng)利用人源性CTCs成功構(gòu)建了乳腺癌[45]、胰腺癌[46]和前列腺癌[47]的PDX模型。這些模型對(duì)于研究CTCs在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制十分重要。

3 局限性和未來(lái)發(fā)展方向

本篇綜述主要討論了類器官和人源性腫瘤組織異種移植在腫瘤研究中的應(yīng)用情況。雖然二者相比于傳統(tǒng)的細(xì)胞系模型具有廣闊的應(yīng)用前景，但其局限性也不容忽視。

3.1 類器官

首先，類器官培養(yǎng)的固有局限性之一是缺乏基質(zhì)、血管和免疫細(xì)胞[48]。第二，某些類器官的培養(yǎng)體系中需要添加鼠源性細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的替代物(如Matrigel或基底膜提取物)或胎牛血清(生產(chǎn)Wnt條件培養(yǎng)基的成分)，但由于此類物質(zhì)結(jié)合了外來(lái)因子，可能對(duì)藥物篩選結(jié)果產(chǎn)生一定影響[49]。第三，腫瘤類器官容易出現(xiàn)細(xì)胞分裂錯(cuò)誤，因此通常比正常組織類器官生長(zhǎng)速率緩慢，最終導(dǎo)致腫瘤類器官中摻雜的正常細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)。

3.2 PDX模型

首先，PDX模型經(jīng)過(guò)接種、傳代和藥物篩選所需時(shí)間較長(zhǎng)(4～8個(gè)月)，不適宜非常晚期和/或侵襲性很強(qiáng)的腫瘤患者[50]。第二，PDX模型在傳代過(guò)程中將導(dǎo)致特定細(xì)胞亞群的生長(zhǎng)，丟失部分患者原始腫瘤的異質(zhì)性[51]。第三，未能重現(xiàn)人類腫瘤的微環(huán)境。在PDX模型培養(yǎng)過(guò)程中，小鼠的基質(zhì)將逐漸替代人源性基質(zhì)成分[52]。人類腫瘤組織與快速浸潤(rùn)的小鼠基質(zhì)微環(huán)境之間的相互作用，會(huì)影響腫瘤的旁分泌信號(hào)，不利于研究以基質(zhì)為導(dǎo)向的治療方法。第四，缺乏功能性免疫系統(tǒng)[53]。

4 結(jié)語(yǔ)

目前雖然細(xì)胞系依舊是腫瘤研究中最常用的模型，并可能繼續(xù)在腫瘤藥物研究等領(lǐng)域發(fā)揮重大作用。然而，PDOs、PDXs等新興模型能夠更好地反映腫瘤異質(zhì)性，更全面地概括人類腫瘤特征。目前二者已經(jīng)逐漸成為腫瘤臨床前研究和基礎(chǔ)研究的好幫手。雖然仍然存在著諸多限制，但隨著培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展成熟，成功率也將不斷提高。預(yù)期在不久的將來(lái)，研究者能以更高效的方式成功建模，為腫瘤患者開發(fā)個(gè)體化治療手段。