郭彩霞，于洪濤，石紅梅，商玉立

(河南省胸科醫(yī)院呼吸內(nèi)科，鄭州 450000)

肺間質(zhì)纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是由自身免疫、生物因素、物理因素、免疫因素等多種因素誘發(fā)的慢性肺部疾病發(fā)展至晚期的一個(gè)相同的病理變化，該病發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，目前缺乏治療該病的有效手段[1]。因此，尋找治療PF有效的途徑成為研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。近些年研究顯示，成纖維細(xì)胞可通過自身異常增殖及轉(zhuǎn)型，作用于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)等一些炎癥和細(xì)胞因及上皮細(xì)胞，或分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)而間接的參與PF的發(fā)展進(jìn)程[2-3]。TGF-β1是促進(jìn)纖維化的一個(gè)最重要的細(xì)胞因子，已有多項(xiàng)研究顯示，PF中TGF-β1表達(dá)升高，TGF-β1可誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞(FB)的增殖和轉(zhuǎn)分化[4-5]。因此，本研究采用TGF-β1誘導(dǎo)人胚肺成纖維細(xì)胞系MRC-5以建立PF的模型。環(huán)氧合酶-2(COX-2)是一個(gè)重要的合成前列腺素過程中的限速酶，有研究顯示，在PF大鼠及患者肺組織中存在COX-2的高表達(dá)，可能參與PF的發(fā)生發(fā)展[6-7]，但COX-2如何影響PF及機(jī)制尚未明確，因此，本研究通過TGF-β1刺激及COX-2的siRNA轉(zhuǎn)染人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5，在細(xì)胞水平上檢測(cè)抑制COX-2表達(dá)對(duì)MRC-5細(xì)胞活力、膠原合成、EMT標(biāo)志物及Notch信號(hào)通路的影響，以期為PF的治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人胚肺成纖維細(xì)胞系MRC-5購(gòu)自美國(guó)ATCC。

1.2 主要試劑與儀器

胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素雙抗均購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；TGF-β1購(gòu)自Peprotech公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；LOWRY蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海邦奕；COL-Ⅰ、COL-Ⅲ抗體購(gòu)自武漢博士德；COX-2、平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin, α- SMA)、Notch1和Jagged1抗體均購(gòu)自美國(guó)Abacm；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

MRC-5細(xì)胞在含有10%小牛血清及青霉素和鏈霉素各100 U/mL的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于5%CO2培養(yǎng)箱37℃條件培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)為貼壁，每2 d細(xì)胞進(jìn)行一次傳代，實(shí)驗(yàn)選擇生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前接種生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的MRC-5細(xì)胞于6孔培養(yǎng)板中用DMEM(含有血清不含抗生素)培養(yǎng)，并將細(xì)胞濃度調(diào)整為每毫升含1.0×105～2.0×105個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)24 h貼壁，棄掉舊的培養(yǎng)液，將細(xì)胞分為對(duì)照組、TGF-β1組(2μg/L的TGF-β1刺激細(xì)胞)、COX-2-siRNA組(2μg/L的TGF-β1刺激細(xì)胞48 h后再將COX-2-siRNA進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染)和NC組(2μg/L的TGF-β1刺激細(xì)胞48 h后瞬時(shí)轉(zhuǎn)染無干擾作用的siRNA)，轉(zhuǎn)染參照LipofectamineTM2000說明，于培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)48 h。

1.3.2 轉(zhuǎn)染后的MRC-5細(xì)胞中COX-2的表達(dá)檢測(cè)

參照Trizol Regent試劑盒說明提取轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的各組細(xì)胞中的總RNA，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，采用20 μL體系將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，參照RT-PCR說明，采用20 μL的擴(kuò)增體系，以β-actin為內(nèi)參基因，通過熒光定量PCR儀對(duì)COX-2的表達(dá)進(jìn)行擴(kuò)增，引物均有上海生工合成，序列如下：COX-2 F 5′-GTCTGATGATGTATGCCACAATCTG-3′，R 5′-GATGCCAGTGATAGAGGGTGTTAAA-3′；擴(kuò)增片段276 bp。 β-actin F 5′-AACCCTAAGGCCAACCGTG AAAAG-3′，R 5′-TCATGAGGTAGTCTGTCAGGT-3′。擴(kuò)增片段為241 bp。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存。COX-2相對(duì)表達(dá)量根據(jù)RT-PCR所得Ct均值通過2-△△Ct計(jì)算獲得。

1.3.3 蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)

將1 mL的RIPA(含有10%的PMSF)蛋白裂解液加入轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，置于冰上裂解反應(yīng)30 min，離心，收集蛋白，Lowry法對(duì)蛋白含量進(jìn)行檢測(cè)，每孔道取上樣蛋白50 μg進(jìn)行電泳，電泳后半干法轉(zhuǎn)凝膠至PVDF膜，轉(zhuǎn)好的PVDF膜于50 g/L的脫脂奶粉封閉液中封閉2 h，洗膜，加入適當(dāng)稀釋比例的一抗4℃過夜，COX-2、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、α- SMA、Notch1和Jagged1皆按照1∶500稀釋，β-actin為1∶1000稀釋，洗膜后加入二抗，室溫條件孵育二抗1 h，ECL試劑顯色，置于暗室中顯影定影。

1.3.4 各組細(xì)胞活力檢測(cè)

收集轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，避光條件下加MTT溶液10 μL于每孔中，5%CO2培養(yǎng)箱37℃條件培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)至?xí)r間后棄掉上清液，加入DMSO溶液150 μL于每孔中，混合均勻后震蕩10 min，放入酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)測(cè)定各組細(xì)胞各個(gè)孔的吸光度值(OD值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1誘導(dǎo)的MRC-5細(xì)胞中COX-2的表達(dá)

TGF-β1刺激MRC-5細(xì)胞48 h后，通過Western blotting檢測(cè)COX-2在MRC-5細(xì)胞的表達(dá)，結(jié)果如圖1所示，Control組、TGF-β1組、NC組和COX-2-siRNA組COX-2的蛋白表達(dá)分別為(0.052±0.010)、(0.467±0.048)、(0.483±0.046)、(0.153±0.017)，Control組、TGF-β1組、NC組和COX-2-siRNA組COX-2的蛋白表達(dá)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=119.763,P<0.05)，TGF-β1組COX-2的表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，NC組COX-2的表達(dá)與TGF-β1組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，COX-2-siRNA組COX-2的表達(dá)顯著低于TGF-β1組(P<0.05)。

注：A：各組細(xì)胞中COX-2的蛋白表達(dá)；B：COX-2的蛋白相對(duì)表達(dá)；與Control組比較，*P<0.05；與TGF-β1組比較，#P<0.05。圖1 COX-2在TGF-β1誘導(dǎo)的MRC-5細(xì)胞中的表達(dá)Note. A: COX-2 protein expression in the cells of each experimental group. B: Relative COX-2 protein expression. Compared with the control group,*P<0.05. Compared with the TGF-β1 group,#P<0.05.Figure 1 COX-2 expression in the MRC-5 cells activated by TGF-β1

2.2 抑制COX-2表達(dá)對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的MRC-5細(xì)胞活力的影響

CCK8法檢測(cè)各組細(xì)胞活力結(jié)果如圖2所示，Control組、TGF-β1組、NC組和COX-2-siRNA組OD值分別為(0.327±0.028)、(0.669±0.053)、(0.653±0.056)、(0.431±0.041)，4組OD值比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=40.457,P<0.05)，與對(duì)照組比較，TGF-β1組OD值顯著升高(P<0.05)，與TGF-β1組比較，COX-2-siRNA組OD值顯著降低(P<0.05)。

注：與Control組比較，*P<0.05；與TGF-β1組比較，#P<0.05。圖2 抑制COX-2表達(dá)對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的MRC-5細(xì)胞活力的影響Note. Compared with the control group,*P<0.05. Compared with the TGF-β1 group,#P<0.05.Figure 2 The effects of inhibition of COX-2 expression on the TGF-β1-dependent activation of MRC-5 cells

2.3 抑制COX-2表達(dá)對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的MRC-5細(xì)胞膠原合成的影響

Western blotting檢測(cè)COL-Ⅰ和COL-Ⅲ的蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖3所示，Control組、TGF-β1組、NC組和COX-2-siRNA組COL-Ⅰ的蛋白表達(dá)分別為(0.083±0.008)、(0.405±0.039)、(0.413±0.036)、(0.182±0.021)，COL-Ⅲ的蛋白達(dá)分別為(0.078±0.007)、(0.297±0.032)、(0.282±0.034)、(0.153±0.016)，4組COL-Ⅰ、COL-Ⅲ的蛋白表達(dá)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F1=97.995,F2=53.442，P<0.05)，與對(duì)照組比較，TGF-β1組COL-Ⅰ和COL-Ⅲ的表達(dá)均顯著升高(P<0.05)，與TGF-β1組比較，COX-2-siRNA組COL-Ⅰ和COL-Ⅲ的表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。

注：A：Western blotting檢測(cè)COL-Ⅰ和COL-Ⅲ的蛋白表達(dá)；B：COL-Ⅰ和COL-Ⅲ的蛋白相對(duì)表達(dá)量；與Control組比較，*P<0.05；與TGF-β1組比較，#P<0.05。圖3 抑制COX-2表達(dá)對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的MRC-5細(xì)胞膠原合成的影響Note. A: Western blotting was used to detect the expression of COL-I and COL-III proteins. B: The relative expression of COL-I and COL-III protein. Compared with the control group,*P<0.05. Compared with the TGF-β1 group,#P<0.05.Figure 3 The effects of inhibition of COX-2 expression on the TGF-β1-dependent synthesis of collagen in the MRC-5 cells

2.4 抑制COX-2表達(dá)對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的MRC-5細(xì)胞EMT標(biāo)志物表達(dá)的影響

Western blotting檢測(cè)抑制COX-2表達(dá)對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的MRC-5細(xì)胞EMT標(biāo)志物α-SMA 的影響，結(jié)果如圖4所示，Control組、TGF-β1組、NC組和COX-2-siRNA組α-SMA的蛋白表達(dá)分別為(0.091±0.010)、(0.223±0.026)、(0.228±0.028)、(0.096±0.010)，4組α-SMA的蛋白表達(dá)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=42.046,P<0.05)，與對(duì)照組比較，TGF-β1組α-SMA 的表達(dá)顯著升高(P<0.05)，與TGF-β1組比較，COX-2-siRNA組α-SMA 的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。

注：A：Western blotting檢測(cè)α-SMA的蛋白表達(dá)；B：α-SMA 的蛋白相對(duì)表達(dá)量；與Control組比較，*P<0.05；與TGF-β1組比較，#P<0.05。圖4 抑制COX-2表達(dá)對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的MRC-5細(xì)胞EMT標(biāo)志物表達(dá)的影響Note. A: Western blotting was used to detect α-SMA protein expression in MRC-5 cells. B: Relative α-SMA protein expression. Compared with the control group,*P<0.05. Compared with the TGF-β1 group,#P<0.05.Figure 4 The effects of inhibition of COX-2 expression on the TGF-β1-dependent induction of EMT markers in the MRC-5 cells

2.5 抑制COX-2表達(dá)對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的MRC-5細(xì)胞Notch信號(hào)通路的影響

通過Western blotting檢測(cè)Notch信號(hào)通路受體Notch1 和配體Jagged1的蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖5所示，Control組、TGF-β1組、NC組和COX-2-siRNA組Notch1的蛋白表達(dá)分別為(0.102±0.010)、(0.826±0.069)、(0.810±0.065)、(0.257±0.032)，Jagged1的蛋白表達(dá)分別為(0.075±0.008)、(0.259±0.031)、(0.262±0.034)、(0.109±0.017)，4組的Notch1、Jagged1的蛋白表達(dá)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F1=166.102，F(xiàn)2=46.923,P<0.05)，與對(duì)照組比較，TGF-β1組Notch1和Jagged1的表達(dá)均顯著升高(P<0.05)，與TGF-β1組比較，COX-2-siRNA組Notch1和Jagged1的表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。

注：A：Western blotting檢測(cè)Notch1 和Jagged1的蛋白表達(dá)；B：Notch1 和Jagged1的蛋白相對(duì)表達(dá)量；與Control組比較，*P<0.05；與TGF-β1組比較，#P<0.05。圖5 抑制COX-2表達(dá)對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的MRC-5細(xì)胞Notch信號(hào)通路的影響Note. A: Western blotting was used to detect Notch1 and Jagged1 protein expression. B: Relative expression of Notch1 and Jagged1 protein. Compared with the control group,*P<0.05. Compared with the TGF-β1 group,#P<0.05.Figure 5 The effects of inhibition of COX-2 expression on Notch pathway signaling in the MRC-5 cells activated by TGF-β1

3 討論

PF是常見的一種肺間質(zhì)疾病，目前尚缺乏治療該病的有效方法，已有研究表明肺FB的增殖、分化、活化是影響PF的中心事件[9]。FB的增殖或凋亡不足是形成PF的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，降低FB的增殖和活化，誘導(dǎo)其凋亡可有效的降低PF[10]。目前PF的病因及發(fā)病機(jī)制尚未清楚，但可以明確的是多種細(xì)胞因子影響了PF的發(fā)生發(fā)展，TGF-β在這些細(xì)胞因子中尤為重要，TGF-β可促使FB表型向肌FB表型轉(zhuǎn)化，而肌FB內(nèi)的α-SMA與組織器官收縮存在密切聯(lián)系，且分泌ECM，從而在PF發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[11-12]。目前，已有大量研究表明TGF-β1可通過刺激FB細(xì)胞的增殖、膠原合成、分化等，從而引起PF的發(fā)生發(fā)展[13-14]。COX-2是一個(gè)重要的在合成前列腺素過程中的限速酶，目前在PF中的研究較少，有研究顯示，在肺纖維化大鼠及患者肺組織中存在COX-2的高表達(dá)，COX-2的抑制劑可降低肺泡早期炎癥[15-16]；抑制肺組織中COX-2表達(dá)可對(duì)大鼠肺損傷起到保護(hù)作用[17]。目前關(guān)于COX-2對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的FB生長(zhǎng)影響尚未明確。

鑒于此，本研究試圖在細(xì)胞水平上研究抑制COX-2表達(dá)對(duì)MRC-5細(xì)胞影響，通過TGF-β1刺激及COX-2的siRNA轉(zhuǎn)染MRC-5，可發(fā)現(xiàn)TGF-β1刺激可明顯提升MRC-5細(xì)胞活力，而抑制COX-2后細(xì)胞活力明顯降低。提示COX-2可影響TGF-β1誘導(dǎo)的MRC-5細(xì)生長(zhǎng)。

在PF時(shí)可形成大量膠原纖維，在PF時(shí)肺內(nèi)的膠原蛋白代謝失衡，肺間質(zhì)可沉積大量的膠原纖維，隨著數(shù)量增多最終可導(dǎo)致肺發(fā)生彌漫性纖維化[18-19]。COL-Ⅰ和COL-Ⅲ是膠原纖維主要生化成分，有研究顯示，在PF時(shí)COL-Ⅰ和COL-Ⅲ的表達(dá)均明顯增多[20]。在TGF-β1誘導(dǎo)的PF中，α-SMA、波形蛋白、N-鈣黏蛋白等間質(zhì)表型標(biāo)志物表達(dá)升高，因此選擇α-SMA作為評(píng)定TGF-β1誘導(dǎo)的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制[21]。本研究結(jié)果顯示，TGF-β1刺激可上調(diào)COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、α-SMA表達(dá)，而COX-2-siRNA可抑制其表達(dá)。這提示抑制COX-2表達(dá)可通過下調(diào)COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、α-SMA表達(dá)降低PF的膠原合成及轉(zhuǎn)化。

多項(xiàng)研究表明，Notch信號(hào)通路在PF中發(fā)揮重要作用，尤其在FB向肌FB轉(zhuǎn)化中尤為重要[22]。有研究顯示，Notch信號(hào)通路受體Notch1和配體Jagged1在TGF-β1刺激FB細(xì)胞中表達(dá)升高，阻斷Notch信號(hào)通路后Notch1和Jagged1的表達(dá)均明顯降低[23-24]。本研究結(jié)果顯示，TGF-β1刺激可上調(diào)MRC-5細(xì)胞Notch1和Jagged1的表達(dá)，COX-2-siRNA可降低MRC-5細(xì)胞Notch1和Jagged1的表達(dá)。提示COX-2可能通過抑制Notch信號(hào)通路降低PF發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)抑制COX-2基因表達(dá)可能通過降低人胚肺成纖維細(xì)胞系MRC-5細(xì)胞活力、抑制膠原合成和轉(zhuǎn)化及下調(diào)Notch信號(hào)通路，從而對(duì)肺纖維化起保護(hù)作用。本研究提示COX-2可能是一個(gè)反映纖維化程度的新型指標(biāo)，可能成為新的用于抗肺纖維化的分子治療靶點(diǎn)。值得進(jìn)一步深入探究。