張鵬，劉盼，周蘭，裴婷，甘喆，李浩東，宋發(fā)軍

(中南民族大學 生命科學學院 生物技術(shù)國家民委重點實驗室/武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護與利用湖北省重點實驗室，武漢430074)

內(nèi)生真菌是抗癌藥物紫杉醇的重要藥源途徑之一[1].自1993年首次報道發(fā)現(xiàn)產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌-Taxomyceandreanae[2]后，已有幾百株產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌被報道[3].Somjaipeng S等[4]從溫帶紅豆杉中分離篩選出兩株內(nèi)生真菌Paraconiothyriumvariabile和黑附球菌(Epicoccumnigrum)，紫杉醇產(chǎn)量分別為1.75,1.32 μgL-1.Sah B等[5]從胡椒中分離出一株產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌龍眼焦腐病菌(Lasiodiplodiatheobromae)，紫杉醇產(chǎn)量為247 μgL-1. El-Sayed等[6]分別從羅漢松的纖毛木和枝條中分離到3株產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌，土曲霉EFB108, EFB59, EFB14，其中EFB108紫杉醇產(chǎn)量較高為265 μgL-1.但目前關(guān)于內(nèi)生真菌的紫杉醇合成途徑尚不清楚，其紫杉醇合成相關(guān)基因的報道極少[7]，嚴重限制了內(nèi)生真菌紫杉醇合成的分子機理研究及高產(chǎn)工程菌株的創(chuàng)建.

枝狀枝孢霉(Cladosporiumcladosporioides，簡稱枝霉) MD2是本課題組前期分離的產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌，在完成其轉(zhuǎn)錄組分析[8]的基礎(chǔ)上，本文克隆了枝霉MD2的紫杉醇合成相關(guān)候選基因A00981，采用生物信息學技術(shù)預(yù)測其結(jié)構(gòu)和功能，構(gòu)建了該基因的超表達載體并轉(zhuǎn)化枝霉MD2，通過抗性篩選和分子鑒定，共獲得9株轉(zhuǎn)基因菌株，其中5株轉(zhuǎn)基因菌株的外源基因是以單拷貝方式插入，為深入研究候選基因A00981的功能奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枝霉MD2和根癌農(nóng)桿菌AGL-1為本實驗室保存.T4 DNA連接酶、SpeI、Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶(TAKARA)；RNA提取試劑盒(TIANGEN)；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(TOYOBO)；DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit(Roche)；引物合成及測序(武漢擎科生物科技).

高速冷凍離心機(FRESCO 21，Thermo)；PCR儀(C1000 Touch，Bio-Rad)；生化培養(yǎng)箱(SPX智能型，寧波江南儀器廠)；分子雜交儀(QF-1，上海喬楓實業(yè)).

1.2 候選基因A00981 的克隆與生物信息學分析

參考課題前期報道[9]提取枝霉MD2的基因組DNA和總RNA，并將RNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA.采用引物A00981-F：5′-ATGGCCGGAATGGCAATC-3′和A00981-R：5′-CTACAATCTCGCCTTGGG-3′分別擴增候選基因的DNA和cDNA序列.擴增條件為：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性15 s, 55 ℃復(fù)性15 s, 72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min.擴增產(chǎn)物經(jīng)測序驗證后，參照前期報道[10]，采用Vector NTI 比對A00981的DNA序列與cDNA序列，分析其是否有內(nèi)含子.采用Blastp, ProtParam, ProtScale, TMHMM, SignalP 4.1, NCBI中CDD, SMART, SWISS-MODEL等軟件進行候選基因的生物信息學分析.

1.3 過表達載體pTFC-A00981 的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

先采用Overlapping方法將PtrpC啟動子、候選基因A00981和TtrpC終止子依次連接構(gòu)建其表達框，再將其表達框于SpeI位點插入pTFC質(zhì)粒構(gòu)建候選基因的過表達載體pTFC-A00981.采用熱激法將pTFC-A00981轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌AGL-1，并參照本實驗室前期建立的轉(zhuǎn)化體系轉(zhuǎn)化枝霉MD2[11].最后，通過潮霉素(30 mgL-1)抗性篩選及連續(xù)2次繼代培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)基因菌株.

表1 A00981基因表達框構(gòu)建所需引物Tab.1 Primer sequences for construction of A00981 gene expression cassette

注：下劃線為限制性酶切位點

1.4 轉(zhuǎn)基因菌株的檢測

分別提取轉(zhuǎn)基因菌株和對照(未轉(zhuǎn)基因)菌株的基因組DNA為模板，采用引物hptII-F： 5′-ATGAAAAAGCCTGAACTCAC-3′和hptII-R：5′-CTATTCCTTTGCCCTCGGAC-3′檢測潮霉素基因(hygromycin resistance gene,hptII)的轉(zhuǎn)化情況；并用Hind Ⅲ完全酶切各個轉(zhuǎn)基因菌株和對照菌株(陰性對照)的基因組DNA，并以pTFC-A00981質(zhì)粒作陽性對照，采用Southern blot分析轉(zhuǎn)基因菌株的外源基因的轉(zhuǎn)化情況.

2 結(jié)果與分析

2.1 候選基因A00981 的克隆與分析

候選基因A00981的cDNA序列為894 bp，DNA序列為969 bp，含有1個75 bp的內(nèi)含子.Blast P比對結(jié)果表明，候選基因A00981的編碼蛋白與柑橘澳洲痂囊腔菌(Elsinoeaustralis)的?；o酶A脫氫酶(acyl-CoA dehydrogenase，ACAD,GenBank No.PSK41880.1)有73%的一致性；與Sphacelomamurrayae的ACAD (GenBank No.PNS15105.1) 和ExophialadermatitidisNIH/UT8656 的ACAD (XP_009152775.1)有72%的一致性；與AureobasidiumnamibiaeCBS 147.97的ACAD (XP_013430645.1)有71%的一致性(見圖1).

圖1 候選基因A00981的系統(tǒng)進化分析Fig.1 phylogenetic analysis of candidate gene A00981

ProtParam預(yù)測結(jié)果表明該基因編碼蛋白包含298個氨基酸，相對分子量為32823.12Da，等電點(pI)為9.14，分子式為C1458H2331N401O421S19.ProtScale,TMHMM和SignalP4.1預(yù)測結(jié)果表明，該基因編碼蛋白為親水蛋白(圖2A)、無跨膜結(jié)構(gòu)域(圖2B)和信號肽(圖2C).經(jīng)NCBI中CDD,SMART,SWISS-MODEL預(yù)測結(jié)果表明：A00981編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域被注釋為?；o酶A脫氫酶(圖2D)，在C端和N端各有1個ACDA催化結(jié)構(gòu)域(圖2E)，三級結(jié)構(gòu)與嗜堿土芽孢桿菌(Geobacillus kaustophilus)ACDA晶體結(jié)構(gòu)同源性為28.04%，并利用同源建模法預(yù)測了該蛋白的三級結(jié)構(gòu)(圖2F).

A)親疏水性; B) 跨膜結(jié)構(gòu)域; C) 信號肽; D) 保守結(jié)構(gòu)域; E) 二級結(jié)構(gòu)域; F) 三級結(jié)構(gòu)圖2 候選基因A00981的生物信息學預(yù)測Fig.2 Bioinformatics analysis of candidate gene A00981

2.2 pTFC-A00981 載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

采用overlapping方法構(gòu)建約1865 bp的表達框(PtrpC-A00981-TtrpC)，并插入pTFC質(zhì)粒的多克隆位點構(gòu)建候選基因的過表達載體pTFC-A00981，經(jīng)SpeI酶切驗證正確(圖3A)后，轉(zhuǎn)化枝霉MD2.將轉(zhuǎn)基因菌株通過抗性篩選及連續(xù)兩次繼代(5 d/代)后，與未轉(zhuǎn)基因(對照)菌株分別接種于含有潮霉素的抗性平板培養(yǎng)5 d，結(jié)果表明，對照菌株不能正常生長，而轉(zhuǎn)基因菌株在抗性平板上長勢良好(圖3B).本研究共獲得9株轉(zhuǎn)基因菌株.

M) DL2000; 1) 質(zhì)粒酶切; A) pTFC-A00981的酶切分析; B) 轉(zhuǎn)基因菌株(左)和對照菌株(右)的抗性驗證圖3 pTFC-A00981載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因菌株的抗性驗證Fig.3 Construction of pTFC-A00981 and resistance verification of A00981-transgenic strains

2.3 轉(zhuǎn)基因菌株的檢測

抗性基因hptII的擴增結(jié)果(圖4A)表明，9株A00981-轉(zhuǎn)基因菌株均可擴增到hptII基因，而對照菌株無擴增產(chǎn)物，初步說明含有抗性基因hptII的T-DNA片段與宿主染色體整合.Southern blot檢測結(jié)果進一步表明，9株轉(zhuǎn)基因菌株的外源基因均成功與宿主染色體整合；其中5株轉(zhuǎn)基因菌株的外源基因是以單拷貝方式整合，對照菌株含有1個拷貝的候選基因A00981(圖4B).

M1) DL2000; M2) DL λ-DNA/Hind Ⅲ; 1) 對照菌株; 2) pTFC-A00981; 3～11) A00981/MD2轉(zhuǎn)基因菌株 A)hpt II基因的擴增; B) 轉(zhuǎn)基因菌株的Southern blot分析圖4 A00981/MD2轉(zhuǎn)基因菌株的分子驗證Fig.4 Molecular identification of A00981/MD2 transgenic strains

3 討論

本研究首次從產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌枝霉MD2中克隆了候選基因A00981，生物信息學預(yù)測結(jié)果表明該基因編碼蛋白在C端和N端均具有ACAD催化結(jié)構(gòu)域，與柑橘澳洲痂囊腔菌(E.australis)的ACAD具有73%的一致性，因此，候選基因A00981的功能可能是通過編碼ACAD酶，調(diào)節(jié)脂肪酸β氧化，為宿主紫杉醇合成的MVA途徑提供乙酰輔酶A，調(diào)節(jié)真菌枝霉MD2紫杉醇合成.在此基礎(chǔ)之上，本研究構(gòu)建了候選基因A00981的過表達載體并轉(zhuǎn)化枝霉MD2，共獲得9株轉(zhuǎn)基因菌株，其中5株轉(zhuǎn)基因菌株的外源基因是以單拷貝方式插入.這些轉(zhuǎn)基因菌株的獲得為后期深入分析候選基因A00981對宿主紫杉烷類合成的作用奠定了基礎(chǔ).