劉欣，周宋匯﹡，孫科

(1 江蘇省腫瘤醫(yī)院,江蘇省腫瘤防治研究所，南京醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院， 南京 210009；2 徐州生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程系，徐州 221006)

達(dá)托霉素(doxymycin)是一種環(huán)狀脂肽類抗生素，可以由玫瑰孢鏈霉菌(Streptomycesroseosporus)發(fā)酵得到.達(dá)托霉素對絕大多數(shù)G+菌具有殺滅的功能，更主要的是它可以作用于耐藥菌如耐甲氧西林金葡菌(MRSA)、耐萬古霉素腸球菌(VRE)、耐萬古霉素金葡菌(VRSA)等[1,2],近年來成為醫(yī)藥界的研究熱點(diǎn).

達(dá)托霉素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，化學(xué)合成難度較大，通常采用生物發(fā)酵方法進(jìn)行生產(chǎn). 但是發(fā)酵法產(chǎn)量較低，一直限制其在我國的規(guī)模使用. 目前國內(nèi)提高達(dá)托霉素發(fā)酵效價的研究多集中在對優(yōu)良菌種的選育上，如采用聯(lián)合抗性篩選法、紫外誘變方法、氦氖激光輻照-亞甲基胍復(fù)合誘變法來篩選優(yōu)良菌種[3-5]. 最新的文獻(xiàn)顯示，周劍等[6]通過流加補(bǔ)料發(fā)酵方式最終使達(dá)托霉素產(chǎn)量達(dá)到380 mg/L. 本研究以本實(shí)驗(yàn)室篩選的誘變玫瑰孢鏈霉菌FN2015為發(fā)酵菌種，優(yōu)化各項(xiàng)發(fā)酵條件，為大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)達(dá)托霉素提供可供借鑒的理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玫瑰孢鏈霉菌(Streptomycesroseosporus) FN2015，實(shí)驗(yàn)室保藏菌種.

玉米漿試劑級；酵母浸膏、瓊脂粉、葡萄糖、氯化鈉、七水硫酸鎂、三水磷酸氫二鉀、七水硫酸亞鐵、糊精等為國產(chǎn)分析純試劑；消泡劑食品級.

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖2.0%，酵母浸膏1.0%，氯化鈉0.05%，七水硫酸鎂0.1%，三水磷酸氫二鉀0.05%，七水硫酸亞鐵0.001%，瓊脂粉1.8%.

種子培養(yǎng)基：糊精2.5%，玉米漿0.5%，七水硫酸鎂0.1%，三水磷酸氫二鉀0.04%.

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉水解糖3.5%，玉米漿0.5%，氯化鉀0.05%，消泡劑0.01%.

1.3 儀器與設(shè)備

SHP-400智能生化培養(yǎng)箱(蘇州威爾)；無菌超凈工作臺(JB-CJ-1500FX，蘇州佳寶) ；多振幅軌道恒溫?fù)u床(ZWY-103B ，上海圣科)；機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐(20 L，鎮(zhèn)江東方)；臺式高速冷凍離心機(jī)(H1650R，上海齊閔)；高效液相色譜儀(1260型，美國安捷倫).

1.4 方法

1.4.1 玫瑰孢鏈霉菌FN2015的培養(yǎng)

取出保藏在超低溫冰箱中的FN2015的孢子，接種到斜面培養(yǎng)基上，30 ℃、35%～55%的濕度下培養(yǎng)10～12 d，制備孢子懸液濃度為107個/mL. 取1 mL孢子懸液接種到裝100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：28 ℃、200 r/min. 培養(yǎng)42 h后按9%的接種量接種到5 L小型發(fā)酵罐，發(fā)酵條件為：溫度(28±1) ℃、攪拌轉(zhuǎn)速240～300 r/min、空氣流量6～7 L/min、罐壓0.05 MPa.

1.4.2 發(fā)酵條件確定方法

選取對達(dá)托霉素發(fā)酵影響顯著的5個因素溫度、初始pH值、接種量、通風(fēng)量和攪拌轉(zhuǎn)速進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn). 以某個發(fā)酵條件為變量，其他條件固定不變，通過實(shí)驗(yàn)確定此發(fā)酵條件.

1.4.3 發(fā)酵條件優(yōu)化方法

以單因素實(shí)驗(yàn)的5個因素作為影響因子進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，通過Box-Behnken試驗(yàn)水平設(shè)計(jì)[7]，具體的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1，其中溫度為影響因子A、初始pH值為影響因子B、接種量為影響因子C、通風(fēng)量為影響因子D、攪拌轉(zhuǎn)速為影響因子E.

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因子水平設(shè)計(jì)Tab.1 Level design of Box-Behnken test factor

1.4.4 達(dá)托霉素效價測定方法

達(dá)托霉素的效價測定見文獻(xiàn)[8].

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)及結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵溫度對達(dá)托霉素發(fā)酵結(jié)果的影響

其他條件不變，選取不同發(fā)酵溫度24、26、28、30和32 ℃，測定達(dá)托霉素的產(chǎn)量，從圖1 可以看出當(dāng)發(fā)酵溫度為28 ℃時，達(dá)托霉素的產(chǎn)量最高為880.18 mg/L，因此達(dá)托霉素發(fā)酵的最適溫度為28 ℃.

圖1 發(fā)酵溫度對達(dá)托霉素發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on doxymycin fermentation

2.1.2 初始pH值對達(dá)托霉素發(fā)酵結(jié)果的影響

在不同的發(fā)酵初始pH值條件下，當(dāng)發(fā)酵初始pH值為8.0時(圖2)，達(dá)托霉素的產(chǎn)量最高為879.83 mg/L，所以選定達(dá)托霉素發(fā)酵初始pH值為8.0.

圖2 初始pH值對達(dá)托霉素發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of initial pH value on the fermentation of doxymycin

2.1.3 接種量對達(dá)托霉素發(fā)酵結(jié)果的影響

選擇不同的接種量 4%、6%、8%、10%和12%進(jìn)行發(fā)酵，然后測定達(dá)托霉素的產(chǎn)量，從圖3 可以看出當(dāng)接種量為10%時，達(dá)托霉素的產(chǎn)量最高為881.52 mg/L，所以達(dá)托霉素發(fā)酵的最適接種量為10%.

圖3 接種量對達(dá)托霉素發(fā)酵影響Fig.3 Effect of inoculation volume on the fermentation of doxymycin

2.1.4 通風(fēng)量對達(dá)托霉素發(fā)酵結(jié)果的影響

選取不同的通風(fēng)量 3.0、4.0、5.0、6.0和7.0 L/min，測定達(dá)托霉素的產(chǎn)量，當(dāng)通風(fēng)量為6.0 L/min時(圖4)，達(dá)托霉素的產(chǎn)量最高為883.57 mg/L，因此達(dá)托霉素發(fā)酵最適的通風(fēng)量設(shè)為為1.2 L/min.

2.1.5 攪拌轉(zhuǎn)速對達(dá)托霉素發(fā)酵結(jié)果的影響

其他條件不變，分別選取不同的攪拌轉(zhuǎn)速 150、200、250、300和350 r/min，測定達(dá)托霉素的產(chǎn)量，從圖5 可以看出當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速為250 r/min時，達(dá)托霉素的產(chǎn)量最高，為882.69 mg/L，因此選擇250 r/min作為發(fā)酵攪拌速度.

圖4 通風(fēng)量對達(dá)托霉素發(fā)酵影響Fig.4 Effect of ventilation on doxymycin fermentation

圖5 攪拌轉(zhuǎn)速對達(dá)托霉素發(fā)酵影響Fig.5 Effect of stirring speed on the fermentation of doxymycin

2.2 發(fā)酵條件的響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 回歸模型建立

以達(dá)托霉素產(chǎn)量為因變量Y，溫度A、初始pH值B、接種量C、通風(fēng)量D和攪拌轉(zhuǎn)速E為自變量,利用Design-Expert 8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,建立多元回歸模型[9-11]：

Y=100.00+5.94A+16.58B+15.64C+8.37D+

10.31E+10.75AB+4.69AC-3.38AD-5.47AE-

8.05BC+14.38BD-3.06BE+0.93CD+7.27CE-

12.52DE-17.49A2-13.51B2-

18.94C2-27.28D2-15.27E2.

以單因素結(jié)果為依據(jù)設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn)的因素水平，響應(yīng)面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2.

表2 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of the Box-Behnken test

2.2.2 達(dá)托霉素產(chǎn)量的方差分析

對回歸方程進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果見表3.

表3 達(dá)托霉素產(chǎn)量回歸模型方差分析Tab.3 Variance analysis of the yield regression model of doxymycin

從表3可以看出：模型的F值為13.33，Pr>F小于0.0001，表明自變量(A、B、C、D、E)和因變量Y之間線性關(guān)系極顯著，所建立的回歸方程可以對真實(shí)曲面模擬；相關(guān)系數(shù)R2=0.9643表明模型擬合程度高，置信度高[7]，可以利用建立的模型分析達(dá)托霉素產(chǎn)量的變化.

利用Design Expert 8.0.6軟件對回歸方程進(jìn)行一階偏導(dǎo)求解[12,13]，曲面最大點(diǎn)對應(yīng)A=0.42、B=1.35、C=0.32、D=0.45、E=0.21，所對應(yīng)的達(dá)托霉素發(fā)酵的條件分別為：溫度 27.74 ℃、pH值8.36、接種量8.48%、通風(fēng)量6.13 L/min、攪拌轉(zhuǎn)速242 r/min.

2.2.3 達(dá)托霉素發(fā)酵條件實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

為了驗(yàn)證響應(yīng)面結(jié)果的可靠性，采用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)條件(溫度 27.74 ℃、pH值 8.36、接種量 8.48%、通風(fēng)量 6.13 L/min、攪拌轉(zhuǎn)速 242 r/min)進(jìn)行小型發(fā)酵罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，4個平行，結(jié)果顯示，達(dá)托霉素的產(chǎn)量達(dá)到880.48 mg/L.

3 結(jié)語

達(dá)托霉素是一種新型抗生素，主要通過發(fā)酵法進(jìn)行生產(chǎn)，但發(fā)酵產(chǎn)量一直不高限制了達(dá)托霉素的大規(guī)模使用. 本研究在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對達(dá)托霉素發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后發(fā)酵工藝條件為溫度 27.74 ℃、pH值 8.36、接種量 8.48%、通風(fēng)量 6.13 L/min、攪拌轉(zhuǎn)速242 r/min，在此條件下達(dá)托霉素的效價可達(dá)880.48 mg/L，比最新文獻(xiàn)[14-17]報導(dǎo)的結(jié)果高出50%～132%，發(fā)酵效價大幅度提高，此次研究對工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)達(dá)托霉素具有重要的參考價值. 要進(jìn)一步提高發(fā)酵的效價，在發(fā)酵過程中最好篩選出合適的前體，采用流加方式發(fā)酵，這將是本研究下一步的工作.