張 松，喬自林，馬桂蘭，劉麗霞，王家敏，侯蘭新

(1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730030；2. 西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030，3.蘭州民海生物工程有限公司，甘肅 蘭州 730010)

MDCK細(xì)胞(犬腎細(xì)胞，Madin-Darby canine kidney cells，MDCK)系是1958年由Madin等從美國(guó)的一頭Cocker Spanie母曲架犬的腎臟組織中分離得到的[1]。MDCK細(xì)胞呈上皮細(xì)胞樣，容易培養(yǎng)、增殖快、貼壁生長(zhǎng)，也可馴化為懸浮培養(yǎng)，可連續(xù)傳代[2].大量研究表明，MDCK細(xì)胞對(duì)多種不同亞型的流感病毒株敏感.病毒用MDCK細(xì)胞培養(yǎng)的產(chǎn)量高等特點(diǎn)，可以用來(lái)代替雞胚用于疫苗的生產(chǎn)[3-6]。MDCK單克隆細(xì)胞是本實(shí)驗(yàn)室由MDCK工作庫(kù)細(xì)胞通過(guò)有限稀釋法所制備，共制備114株.不同的MDCK單克隆細(xì)胞株在生長(zhǎng)特性上有較大的差異.

本研究前期通過(guò)有限稀釋法將MDCK細(xì)胞進(jìn)行單克隆化，獲得了自建MDCK單克隆細(xì)胞庫(kù)，庫(kù)內(nèi)共有114株單克隆細(xì)胞.現(xiàn)通過(guò)復(fù)蘇MDCK單克隆細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞復(fù)蘇活率、生長(zhǎng)狀態(tài)、生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)形態(tài)等特性，確定MDCK單克隆細(xì)胞庫(kù)的可用性，旨在為后期篩選病毒敏感的MDCK單克隆細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提供資源和理論參考，為流感疫苗的生產(chǎn)提供參考.

1 材料和方法

1.1 MDCK單克隆細(xì)胞

MDCK單克隆細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)利用MDCK工作庫(kù)細(xì)胞(MDCK-W-63)通過(guò)有限稀釋法篩選獲得，共114株.

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶和PBS(蘭州百靈生物技術(shù)有限公司)；胎牛血清(蘭州民海生物有限公司)；臺(tái)盼藍(lán)(廣州展晨生物科技有限公司).

1.3 主要儀器設(shè)備

CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱(上海博訊公司)、生物倒置顯微鏡(日本奧林巴斯光學(xué)科技有限公司)、潔凈操作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司).

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

將儲(chǔ)存于液氮罐中的MDCK單克隆細(xì)胞取出，在37 ℃水中快速融化后置于50 cm2培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加培養(yǎng)基(DMEM+10%胎牛血清)，再置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).待MDCK細(xì)胞生長(zhǎng)至致密單層時(shí)，PBS液清洗，倒出PBS后加入5 mL 0.25%胰酶，緩慢搖動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，使胰酶充分沒(méi)過(guò)細(xì)胞表面，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)消化5 min取出，在顯微鏡下觀察.當(dāng)細(xì)胞全部變圓并開(kāi)始脫落時(shí)棄去胰酶，在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)放置3 min后取出，并倒去胰酶加入15 mL DMEM培養(yǎng)基.將細(xì)胞吹打混勻后按1∶4比例傳代，將細(xì)胞繼續(xù)放入37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.5 細(xì)胞復(fù)蘇活率

待細(xì)胞復(fù)蘇后，將細(xì)胞懸液50 uL加入PE管中，加入50uL 0.5% 臺(tái)盼藍(lán)染液，染色2～3 min.吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片，鏡下取任意視野細(xì)胞計(jì)數(shù).死細(xì)胞能被臺(tái)盼藍(lán)染上色，鏡下可見(jiàn)深藍(lán)色的細(xì)胞，活細(xì)胞不被染色，鏡下呈無(wú)色透明狀.細(xì)胞活率 =(未著色細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞)×100%.

1.6 細(xì)胞生長(zhǎng)速度、狀態(tài)

如1.4中所述進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇并培養(yǎng)至單層致密，將細(xì)胞密度調(diào)整為5×104個(gè)/mL傳代細(xì)胞.將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞兩次.統(tǒng)計(jì)MDCK單克隆細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)需要的時(shí)間，以評(píng)價(jià)細(xì)胞生長(zhǎng)速度.通過(guò)觀察細(xì)胞的邊緣清晰程度、整齊程度與大小差異來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài).

1.7 細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)

如1.4中所述復(fù)蘇細(xì)胞，將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞兩次.觀察細(xì)胞復(fù)蘇貼壁后細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)的種類(lèi).

2 結(jié)果

2.1 MDCK單克隆細(xì)胞的復(fù)蘇活率

MDCK單克隆細(xì)胞庫(kù)內(nèi)114株MDCK單克隆細(xì)胞株復(fù)蘇后，細(xì)胞最低活率為92.1%，最高活率為97.3%，平均活力為0.954 ±0.016，高于制備MDCK單克隆細(xì)胞所使用的工作庫(kù)細(xì)胞.

2.2 MDCK單克隆細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和速度

MDCK單克隆細(xì)胞庫(kù)內(nèi)114株細(xì)胞，2 d長(zhǎng)滿(mǎn)的細(xì)胞株為70株，占61.4%；3 d長(zhǎng)滿(mǎn)的35株，占30.7%；4 d長(zhǎng)滿(mǎn)5株，占4.4%；超過(guò)4 d長(zhǎng)滿(mǎn)的4株，占3.5%. 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞有66株，占57.9%, 一般的細(xì)胞有43株，占37.7%；較差的細(xì)胞共有5株，占4.4%.

表1 MDCK單克隆細(xì)胞生長(zhǎng)速度和狀態(tài)統(tǒng)計(jì)表

2.3 MDCK單克隆細(xì)胞形態(tài)分析

MDCK單克隆細(xì)胞共有3種細(xì)胞形態(tài)，第一類(lèi)為典型的多角上皮樣細(xì)胞形態(tài)，與MDCK母細(xì)胞形態(tài)一致，長(zhǎng)滿(mǎn)單層后呈規(guī)則石塊狀鋪展生長(zhǎng)，貼壁迅速.高倍鏡下細(xì)胞胞質(zhì)豐滿(mǎn)，核仁清晰，如圖1A所示. 第二類(lèi)為梭形成纖維狀細(xì)胞形態(tài)，與MDCK母細(xì)胞的形態(tài)差異較大，細(xì)胞呈梭形、長(zhǎng)條形、不規(guī)則形，呈相互平行排列，細(xì)胞呈現(xiàn)成群放射狀、漩渦狀等形態(tài)，長(zhǎng)滿(mǎn)匯合至100%時(shí)細(xì)胞呈細(xì)枝狀交錯(cuò)生長(zhǎng)，如圖1B所示.第三類(lèi)為島狀樣細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)，與MDCK母細(xì)胞形態(tài)的差異更大.細(xì)胞單個(gè)貼壁，相互分散生長(zhǎng)，一般不連成片、形成集落.相鄰單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)擁擠，細(xì)胞形成島狀樣生長(zhǎng)，如圖1C所示.114株MDCK單克隆細(xì)胞的具體形態(tài)分布見(jiàn)表2，MDCK單克隆細(xì)胞中多角上皮樣細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞有78株，占68%；成纖維樣細(xì)胞有13株，占12%；島狀樣細(xì)胞有23株，占20%.

表2 MDCK單克隆細(xì)胞形態(tài)表

A. 多角上皮樣細(xì)胞(×100)；B.梭形成纖維樣細(xì)胞(×100)；C.島狀樣細(xì)胞(×100)

3 討論

流感對(duì)人類(lèi)健康威脅嚴(yán)重，及時(shí)接種疫苗是預(yù)防流感最有效的方法[7].目前，獲準(zhǔn)生產(chǎn)人用流感疫苗的細(xì)胞系主要有 Vero細(xì)胞和MDCK細(xì)胞[8].近年來(lái)使用MDCK單克隆細(xì)胞生產(chǎn)流感疫苗獲得很大發(fā)展[9].有限稀釋法是制備MDCK單克隆細(xì)胞經(jīng)濟(jì)有效的方法，其通過(guò)細(xì)胞稀釋至每孔只有單個(gè)細(xì)胞后進(jìn)行培養(yǎng)而獲得單克隆化細(xì)胞株，所制備的MDCK單克隆細(xì)胞株在生長(zhǎng)特性上有較大差異.基于此，通過(guò)復(fù)蘇MDCK單克隆細(xì)胞株，統(tǒng)計(jì)所有細(xì)胞的生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)狀態(tài)以及細(xì)胞形態(tài)類(lèi)型及其數(shù)量，確定制備的MDCK單克隆細(xì)胞庫(kù)的可用性.

MDCK細(xì)胞作為生產(chǎn)流感疫苗的基質(zhì)，其培養(yǎng)好壞直接影響著流感病毒的篩選[10].細(xì)胞生長(zhǎng)好壞可通過(guò)細(xì)胞的活率、生長(zhǎng)狀態(tài)、生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)形態(tài)來(lái)綜合評(píng)價(jià)，活率高、狀態(tài)好、速度快、形態(tài)均一的細(xì)胞更適用于科學(xué)研究.細(xì)胞復(fù)蘇后經(jīng)過(guò)培養(yǎng)可以修復(fù)損傷的細(xì)胞膜功能[11]，細(xì)胞活率在復(fù)蘇培養(yǎng)過(guò)程中可以得到顯著提高.本實(shí)驗(yàn)室自建MDCK單克隆細(xì)胞庫(kù)細(xì)胞平均復(fù)蘇活率達(dá)0.954 ±0.016%，與細(xì)胞凍存前后活率差異不大，但比MDCK母細(xì)胞活率高.細(xì)胞的生長(zhǎng)速度是提高實(shí)驗(yàn)效率的重要條件，實(shí)驗(yàn)周期是研究人員要密切關(guān)注的問(wèn)題.生長(zhǎng)速度的提高可以縮短實(shí)驗(yàn)周期，篩選生長(zhǎng)速度快的細(xì)胞就顯得尤為重要.MDCK單克隆細(xì)胞庫(kù)中大多數(shù)細(xì)胞均可在2～3 d長(zhǎng)滿(mǎn)，有利于實(shí)驗(yàn)快速有效地開(kāi)展，縮短了實(shí)驗(yàn)周期.細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)也是影響實(shí)驗(yàn)成功與否的重要因素，生長(zhǎng)狀態(tài)好的細(xì)胞更加有利于得到理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，MDCK單克隆細(xì)胞庫(kù)中生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞占比為57.9%，可為實(shí)驗(yàn)提供可靠的細(xì)胞資源.細(xì)胞形態(tài)的多樣性可以用來(lái)評(píng)價(jià)MDCK單克隆細(xì)胞庫(kù)細(xì)胞的豐富性.本研究中MDCK單克隆細(xì)胞具有三種細(xì)胞形態(tài).

前期實(shí)驗(yàn)自制的MDCK單克隆細(xì)胞庫(kù)內(nèi)細(xì)胞復(fù)蘇活率高，生長(zhǎng)速度快，狀態(tài)良好，庫(kù)內(nèi)細(xì)胞有三種形態(tài)，可為后續(xù)甲型H1N1流感病毒篩選實(shí)驗(yàn)提供敏感細(xì)胞基質(zhì)，為篩選提供豐富的資源，并為流感疫苗的生產(chǎn)參考依據(jù).