奶牛卵巢中一株IBRV的分離鑒定

程凱慧 朱彤 任亞初 張云飛 楚會萌 解曉莉 張亮 楊宏軍

摘要：利用MDBK細胞從奶牛卵巢中分離到一株牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）毒株。設(shè)計擴增IBRV的通用引物，對卵巢組織中的病毒進行PCR 擴增及測序;對卵巢組織感染MDBK細胞，進行IBRV的分離培養(yǎng);測定IBRV的TCID?50，同時利用IBRV FA 進行鑒定。結(jié)果表明，分離到的病毒在MDBK細胞上產(chǎn)生了明顯的病變;用特異性引物可擴增出特異性目的條帶，目的序列與IBRV基因序列一致;該毒株的病毒滴度為106.75 TCID?50/mL。

關(guān)鍵詞：卵巢;牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）;鑒定;細胞病變;TCID?50

中圖分類號：S852.65+9.1文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2019）02-0117-04

Isolation and Identification of an IBRV Strain from Cow Ovary

Cheng Kaihui， Zhu Tong， Ren Yachu， Zhang Yunfei，

Chu Huimeng， Xie Xiaoli， Zhang Liang， Yang Hongjun

（Dairy Cattle Research Center， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 25013?China）

AbstractA strain of IBRV was isolated from cow ovary with MDBK cells. The universal primer of IBRV was designed and amplified， and the ovarian tissue was used for PCR and sequencing. The ovarian tissue infected MDBK cells to isolate the IBRV; the TCID?50 of IBRV was determined and it was identified with IBRV FA. The results showed the cytopathic effect （CPE） generated in MDBK. The specific bands could be amplified by PCR with IBRV primers. The sequencing results showed that the sequence was coincided with the published IBRV sequence. The virus titration of the strain was 106.75 TCID?50/mL.

KeywordsOvary; IBRV; Identification; Cytopathic effect （CPE）; TCID?50

牛傳染性鼻氣管炎病毒 （infectious bovine rhinotracheitis virus， IBRV） 又稱牛皰疹病毒Ⅰ型 （bovine herpesvirus ?BHV-1），是皰疹病毒科（Herpesviridae）α皰疹病毒亞科（Alphaherpesvirinae）水痘病毒屬 （Varicellovirus）的成員。牛傳染性鼻氣管炎（IBR）是由牛傳染性鼻氣管炎病毒引起的一種急性、熱性、接觸性傳染病，以高熱、呼吸困難、流鼻汁、上呼吸道及氣管、黏膜發(fā)炎等為特征，還可造成生殖道感染、結(jié)膜炎、腦膜腦炎、流產(chǎn)和死胎、乳房炎等多種臨床癥狀[1]。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將該病列為B類疾病，也是我國進境動物必檢疾病之一。IBRV廣泛分布于世界各地，每年給各國造成高達30億～60億美元經(jīng)濟損失，嚴重制約了養(yǎng)牛業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展[2]。

20世紀50年代首次在北美發(fā)現(xiàn)牛傳染性鼻氣管炎，70年代我國在進口的種牛中發(fā)現(xiàn)該病[3]，迄今已成為全球性重要疾病。國外疫苗接種后IBRV 抗體陽性率達24.00%～66.67%[4， 5];羅玉江、馮蒙等分別報道了我國不同省市IBRV 的流行情況，陽性率為41.6%～54.1%[6-9];本研究團隊對山東省部分奶牛場進行血清學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)平均感染率為26.67%，但是奶牛卵巢中IBRV的感染率為57.00%，是病毒性卵巢炎的主要病原，給牧場造成嚴重的經(jīng)濟損失。IBRV可以在原代細胞或牛腎、肺、睪丸、鼻甲或氣管等組織細胞及已建立的細胞系如牛腎細胞（MDBK）中分離獲得。樣品多為鼻腔拭子、咽拭子、陰道拭子、包皮清洗液、流產(chǎn)胎兒的胎盤、脾、肺、腎等。鄧沛霖、孔繁德[10，11]等從牛群的陽性血清中分離到該病毒，目前沒有從卵巢中分離到該病毒的報道。本研究從無明顯臨床癥狀的奶牛卵巢中分離到一株IBRV 病毒，并經(jīng)測序等試驗進行確定。

1材料與方法

1.1樣品來源

奶牛卵巢來自山東省定點奶牛屠宰場。

1.2主要試劑與儀器

病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司，2×Easy Taq PCR SuperMix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，IBRV FA 熒光抗體購自青島瑞爾生物技術(shù)有限公司，MDBK細胞為山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心疾病研究室保存。

1.3引物的設(shè)計與合成

參考GenBank中牛傳染性鼻氣管炎病毒的全基因組核酸序列，設(shè)計擴增牛傳染性鼻氣管炎病毒的通用引物，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成，引物序列如表1。

1.4樣品的處理

取奶牛一對卵巢的部分組織進行研磨，反復(fù)凍融3次，用PBS稀釋相應(yīng)的樣本，5 000 r/min 離心5 min，取上清液加入青霉素 （200 IU/mL） 、鏈霉素 （100 μg/mL），用0.22 μm濾膜過濾除菌，分裝，-20℃保存。

1.5病毒DNA的提取及PCR鑒定

取200 μL卵巢組織上清液，按照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書提取IBRV病毒基因組DNA。以提取的IBRV病毒基因組DNA為模板，IBRV-F/R為引物進行PCR擴增。PCR擴增體系：DNA模板2 μL，Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，去離子水補至25 μL。PCR擴增程序：95℃ 5 min;94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個循環(huán);72℃ 10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.6IBRV病毒的分離

選擇生長旺盛的MDBK單層細胞，傾去生長液，PBS清洗兩次，接種處理好的卵巢組織上清液1 mL，37℃吸附1 h，棄去組織液，加入含有2% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每12 h觀察細胞病變情況，連續(xù)觀察7 d。將出現(xiàn)病變（CPE）的細胞反復(fù)凍融3 次，收集細胞病毒液，用細胞病毒液再接種MDBK細胞;沒有出現(xiàn)CPE的細胞進行盲傳，盲傳到第3代，仍沒有出現(xiàn)CPE，視為陰性。

1.7IBRV病毒TCID?50的測定

將分離到的IBRV病毒液做連續(xù)10倍的稀釋（10-1～10-10），將稀釋好的病毒液接種到已長好MDBK單層細胞的96孔微量培養(yǎng)板中，每一稀釋度接種3孔，每孔接種100 μL，同時設(shè)置正常的細胞作為對照。在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，加入維持液100 μL，繼續(xù)在 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。顯微鏡下觀察CPE，連續(xù)觀察5 d，按Reed-Muench法計算TCID?50。

1.8IBRV FA觀察熒光抗體

將觀察完CPE的96孔培養(yǎng)板棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌3遍，拍干;室溫用5%的多聚甲醛固定10 min，棄去固定液，自然晾干，再用PBS洗滌3遍，拍干;加入50 μL IBRV FITC熒光抗體，37℃孵育30 min。用PBST洗滌，拍干，在熒光顯微鏡下觀察熒光。

2結(jié)果與分析

2.1IBRV的PCR 鑒定

用IBRV的特異性引物對卵巢組織上清液進行PCR 擴增，同時設(shè)立陽性、陰性對照，擴增目的片段大小為362 bp，PCR產(chǎn)物測序序列經(jīng)BLAST比對，與IBRV基因序列一致。PCR檢測結(jié)果顯示，114份奶牛卵巢組織IBRV感染率為57%（65/114），部分檢測結(jié)果如圖1。

2.2IBRV的分離

從114份卵巢組織中選取10份在MDBK細胞上進行分離，其中編號為53號的卵巢組織在細胞上傳至第二代出現(xiàn)明顯的CPE，細胞圓縮、拉網(wǎng)，聚集成葡萄串樣，在單層細胞上形成空洞，48 h內(nèi)CPE達到80%左右，細胞大部分脫落。收集到的細胞液經(jīng)IBRV特異性引物擴增，鑒定為陽性。

2.3IBRV的TCID?50

顯微鏡下觀察每個稀釋度出現(xiàn)CPE的孔數(shù)（表2），同時結(jié)合IBRV FA 熒光抗體的數(shù)據(jù)，按Reed-Muench法計算IBRV的TCID?50，分離到的該株IBRV病毒滴度為106.75 TCID?50/mL。

2.4IBRV FA結(jié)果

在熒光顯微鏡下，10-1～10-5稀釋度均能觀察到熒光，10-6稀釋度只有一個孔能看見熒光，細胞呈現(xiàn)脫落、拉網(wǎng)的狀態(tài)（圖2），稀釋度越大熒光數(shù)目越少。

3討論與結(jié)論

牛傳染性鼻氣管炎是由IBRV引起的一種牛急性接觸性傳染病，可通過氣溶膠、病牛的直接接觸等方式傳播，但主要是飛沫經(jīng)呼吸道傳播，可形成潛伏感染和持續(xù)性感染，對牛生殖道和生殖器官有嚴重影響，包括流產(chǎn)和呼吸道疾病。病牛和帶毒動物是主要傳染源，隱性傳染的種公牛因精液帶毒，是最危險的傳染源。病愈?？蓭Ф景肽甑揭荒辏踔粮L，隨著我國規(guī)?；B(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展，牛傳染性鼻氣管炎的威脅也與日俱增。

IBRV病毒能通過血液到達生殖道，影響生殖器官，卵巢是主要的靶器官。 1985年Van der Maaten等[12]研究發(fā)現(xiàn)，從未感染IBRV的奶牛配種后接種IBRV，對其卵巢產(chǎn)生多種影響。目前分離鑒定到的IBRV毒株多數(shù)是從鼻拭子、血液中分離到，還沒有從卵巢中分離到IBRV的報道。

本研究利用MDBK細胞，首次從奶牛卵巢中分離出1株IBRV，測序后顯示與IBRV基因序列一致;該病毒在MDBK細胞上盲傳后能明顯觀察到CPE，用IBRV熒光抗體感染可以看到免疫熒光，說明該分離株為牛傳染性鼻氣管炎病毒。該研究結(jié)果為今后開展IBRV流行病學(xué)調(diào)查、篩選和選育疫苗候選毒株及診斷方法的研究提供了有價值的毒株，同時為該病的防控提供理論支撐。

參考文獻：

[1]薛飛， 朱遠茂， 馬磊. 我國牛傳染性鼻氣管炎研究現(xiàn)狀及防控展望[J]. 中國奶牛， 2016（6）： 39-43.

[2]王洪梅， 趙貴民， 侯佩莉， 等. 牛呼吸道疾病綜合征流行現(xiàn)狀及防控技術(shù)研究進展[J]. 中國畜牧雜志， 2015， 51（16）： 33-39.

[3]夏咸柱， 高宏偉， 華育平. 野生動物疫病學(xué)[M]. 北京：高等教育出版社， 2011.

[4]Fulton R W， d′Offay J M， Dubovi E J， et al. Bovine herpesvirus-1： genetic diversity of field strains from cattle with respiratory disease， genital， fetal disease and systemic neonatal disease and their relationship to vaccine strains[J]. Virus Res.， 2016， 223： 115-121.

[5]Newcomer B W， Givens D. Diagnosis and control of viral diseases of reproductive importance：infectious bovine rhinotracheitis and bovine viral diarrhea[J]. Vet. Clin. N. Am. Food A.， 2016， 32（2）： 425-441.

[6]王永艷， 王仲兵， 鄭明學(xué)， 等. 山西省雁門關(guān)地區(qū)牛傳染性鼻氣管炎感染情況與相關(guān)因素的調(diào)查[J]. 中國畜牧獸醫(yī)， 2010， 37（6）： 194-197.

[7]Hou P， Wang H， Zhao G， et al. Rapid detection of infectious bovine rhinotracheitis virus using recombinase polymerase amplification assays[J]. BMC Vet. Res.， 2017， 13（1）： 386.

[8]羅玉江. 北疆部分規(guī)?；瞿膛VD， IBR， BPI和Brucellosis的流行病學(xué)調(diào)查[D].石河子：石河子大學(xué)， 2015.

[9]馮蒙. 可視化檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒LAMP法的建立及其對流行狀況的初步調(diào)查[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2016.

[10]鄧沛霖， 賀榮蓮， 黃峻， 等. 傳染性牛鼻氣管炎隱性感染牛的病毒分離[J]. 中國獸醫(yī)雜志， 1986（11）： 4-7.

[11]孔繁德， 徐淑菲， 周斌華， 等. 進口奶牛牛傳染性鼻氣管炎病毒的分離與鑒定[J]. 中國動物檢疫， 2006（4）： 29-30.

[12]Van der Maaten M J， Miller J M. Ovarian lesions in heifers exposed to infectious bovine rhinotracheitis virus by non-genital routes on the day after breeding[J]. Vet. Microbiol.， 1985， 10（2）： 155-163.