基于HPLC指紋圖譜的當(dāng)歸不同干燥品質(zhì)量研究△

李旭，李成義*，陳杰，焦彥斌，強(qiáng)正澤，李波，王明偉

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅天士力中天藥業(yè)有限責(zé)任公司，甘肅 定西 748100

當(dāng)歸來源于傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。味甘、辛，性溫。具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便的功效[1]。當(dāng)歸所含化學(xué)成分復(fù)雜多樣，主要涉及揮發(fā)油、有機(jī)酸、多糖和黃酮等成分[2-6]?，F(xiàn)行的當(dāng)歸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)由辨別真?zhèn)蝺?yōu)劣的定性指標(biāo)(如采收期、產(chǎn)地、性狀等)和定量指標(biāo)(如水分、揮發(fā)油、阿魏酸含量等)組成，控制的是當(dāng)歸某部分組分，忽略了多組分的協(xié)同作用。中藥指紋圖譜基于對中藥物質(zhì)群整體作用的認(rèn)識，具有信息量大、特征性強(qiáng)、整體性和模糊性等特點，與中醫(yī)整體觀相適應(yīng)，成為中藥的“化學(xué)條碼”，是實現(xiàn)鑒別中藥真?zhèn)蝺?yōu)劣的可行模式[7-9]。

中藥材產(chǎn)地加工是中藥材生產(chǎn)和品質(zhì)形成必不可少的重要環(huán)節(jié)，這一環(huán)節(jié)的實現(xiàn)使藥材質(zhì)量得以保證，且便于貯存、運(yùn)輸[10-11]。傳統(tǒng)干燥加工方法簡單易行，但往往干燥周期長、費(fèi)時費(fèi)力，無標(biāo)準(zhǔn)可循，導(dǎo)致加工中藥材品質(zhì)參差不齊?，F(xiàn)代干燥加工方法的涌現(xiàn)，為中藥材干燥加工增添了新的內(nèi)容。本實驗采用HPLC指紋圖譜技術(shù)，建立了當(dāng)歸HPLC指紋圖譜，通過相似度評價、主成分分析和聚類分析對當(dāng)歸不同干燥品進(jìn)行了分析，以期為評價當(dāng)歸干燥方法提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，F(xiàn)W177型中草藥粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)，CAV214C型電子天平(美國奧豪斯公司)，BT25S型1/100 000電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司)，Milli-Q Century超純水機(jī)(德國默克公司)。

1.2 材料

對照品阿魏酸、綠原酸(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110753-201718，110753-201718)；洋川芎內(nèi)酯A、正丁基苯酞、Z-藁本內(nèi)酯(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，批號分別為62006-39-7，6066-49-5，4431-01-0)；乙腈為色譜純；其余為分析純。

當(dāng)歸新鮮樣品采自當(dāng)歸主產(chǎn)區(qū)甘肅岷縣，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李成義教授鑒定為傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels的根。將采集的新鮮當(dāng)歸根做不同的干燥處理，樣品信息見表1。

表1 當(dāng)歸樣品信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[12]

色譜柱為TC-C18(2)色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-1%乙酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～25 min，5%～25%A；25～40 min，25%～55% A；40～60 min，55%～80% A)，流速0.6 mL·min-1，檢測波長280 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對照品溶液的制備

取阿魏酸、綠原酸、洋川芎內(nèi)酯A、正丁基苯酞對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解于10 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為0.21、0.25、0.14、0.06 mg·mL-1的阿魏酸、綠原酸、洋川芎內(nèi)酯A、正丁基苯酞混合對照品溶液；精密稱定Z-藁本內(nèi)酯對照品15.23 mg，置于5 mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容至5 mL，即為Z-藁本內(nèi)酯對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取當(dāng)歸藥材粉末約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入20 mL 50%甲醇水，密塞，稱定重量。超聲提取40 min后冷卻，再以50%甲醇水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，靜置。取上清液過0.45 μm微孔濾膜，即為供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 取S11號樣品約1.0 g，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，檢測指紋圖譜。各共有峰的相對峰面積RSD均小于2.56%，相對保留時間RSD均小于0.3%。將連續(xù)進(jìn)樣6次得到的色譜圖導(dǎo)入國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2012.1版)進(jìn)行相似度分析，結(jié)果顯示相似度均大于0.990，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取S11號樣品約1.0 g，精密稱定，按“2.3”項下方法制備1份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，分別在制備后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣檢測，測得各共有峰的相對峰面積RSD均小于2.93%，各共有峰的相對保留時間RSD均小于0.25%。將樣品圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2012.1版)進(jìn)行相似度分析，結(jié)果顯示相似度均大于0.990，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗 分別取S11號樣品6份，每份約1.0 g，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液6份，分別進(jìn)樣檢測。測得各共有峰的相對峰面積RSD均小于2.67%，各共有峰的相對保留時間RSD均小于0.2%。將得到的圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2012.1版)進(jìn)行相似度分析，結(jié)果顯示相似度均大于0.990，表明方法重復(fù)性良好。

2.5 當(dāng)歸藥材指紋圖譜研究

2.5.1 指紋圖譜的建立 取42批當(dāng)歸藥材按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，得到當(dāng)歸不同干燥品的液相色譜圖。取綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、正丁基苯酞、Z-藁本內(nèi)酯對照品按“2.2”項下制備對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，得到綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、正丁基苯酞的混合對照品的液相色譜圖和Z-藁本內(nèi)酯對照品的液相色譜圖，見圖1。將42批當(dāng)歸藥材的液相色譜圖導(dǎo)入國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2012.1版)，設(shè)S41為參照圖譜，采用中位數(shù)、時間窗為0.1的方法，經(jīng)多點校正后對色譜峰進(jìn)行全譜圖匹配，見圖2，并生成共有模式的對照指紋圖譜，見圖3。

2.5.2 共有峰的標(biāo)定 根據(jù)所建立的當(dāng)歸指紋圖譜，在對照指紋圖譜上共標(biāo)定出24個共有峰，見圖3。通過與對照品溶液色譜圖的比對，指認(rèn)了其中的4個共有峰，分別為7號峰綠原酸、11號峰阿魏酸、22號峰洋川芎內(nèi)酯A、24號峰Z-藁本內(nèi)酯。經(jīng)比對，22號峰后緊接著出的峰(52.4 min)為正丁基苯酞，在某些樣品中未檢測到該峰。其中11號峰阿魏酸分離度高，是2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定的當(dāng)歸指標(biāo)性成分且峰面積較大，故以其作為參照峰計算其余各峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同干燥處理的樣品相對保留時間RSD均<3%，而相對峰面積的RSD偏大，說明當(dāng)歸不同干燥品的共有成分相對含量差異較明顯。

2.5.3 相似度評價 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2012.1版)對 42 批樣品的指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計算 42批當(dāng)歸和對照指紋圖譜之間的相似度，結(jié)果見表2，相似度均大于0.920，表明當(dāng)歸不同干燥品間相似度較好。

2.5.4 當(dāng)歸不同干燥品HPLC指紋圖譜比較 根據(jù)計算得到的共有峰相對保留時間和相對峰面積分析，當(dāng)歸不同干燥品差異主要集中在峰面積上，即化學(xué)成分的種類差別不大，但各共有峰對應(yīng)化學(xué)成分的含量均有明顯差異。值得注意的是，S40～S42(陰干樣品)中正丁基苯酞峰(出峰時間52.4 min)未檢測到，可能是因為陰干過程耗時長，該成分損耗較大；S37～S39(熏干樣品)在13.2 min處比其他樣品多出了1個峰，且峰面積較大，可能為傳統(tǒng)熏干當(dāng)歸的特征峰。

注：1.綠原酸；2.阿魏酸；3.洋川芎內(nèi)酯A；4.正丁基苯酞；5.Z-藁本內(nèi)酯。圖1 混合對照品HPLC圖(A)和Z-藁本內(nèi)酯對照品HPLC圖

圖2 42批當(dāng)歸藥材疊加指紋圖譜

圖3 對照指紋圖譜

表2 不同干燥品指紋圖譜相似度評價

2.6 主成分分析

將共有峰峰面積導(dǎo)入SPSS 21.0軟件，對24個共有峰進(jìn)行主成分分析，得到24個共有峰的初始特征值和方差貢獻(xiàn)率(表3)。前5個成分的方差累積貢獻(xiàn)率達(dá)86.093%，特征根大于1，可以代表當(dāng)歸指紋圖譜中24個共有峰的大部分信息。由因子載荷矩陣得到主成分載荷矩陣U，以特征向量U值作為系數(shù)，得到5個主成分的表達(dá)式，將原始變量標(biāo)準(zhǔn)化處理后計算得到Y(jié)1、Y2、Y3、Y4、Y5的值。以各公因子的旋轉(zhuǎn)之前的方差貢獻(xiàn)率為權(quán)重系數(shù)，計算當(dāng)歸不同干燥品的綜合得分，Y=0.418Y1+0.186Y2+0.128Y3+0.077Y4+0.052Y5。由表4可知，排名靠前的樣品有60 ℃微波干燥、減壓干燥、60 ℃熱泵干燥品。

表3 主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率

表4 當(dāng)歸不同干燥品綜合得分及排名

2.7 聚類分析

以主成分得分作為變量，運(yùn)用組間聯(lián)接法進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見圖4。當(dāng)歐氏距離為25時，14批樣品可分為兩大類，S37、S38、S39聚為一類，其余樣品聚為另一類，即熏干樣品單獨聚為一類，其余干燥方法得到的樣品聚為一類。歐氏距離為18時，剩余干燥品聚為兩類，陰干和曬干品聚為一類，其余聚為另一類。

圖4 當(dāng)歸指紋圖譜聚類分析

3 討論

為保證建立的當(dāng)歸不同干燥品HPLC指紋圖譜出峰數(shù)目多、分離度好，本實驗前期對色譜條件進(jìn)行了考察?？疾炝思状?水、乙腈-水、乙腈-1%乙酸水三種流動相，發(fā)現(xiàn)以乙腈-1%乙酸水溶液為流動相分離效果最佳，出峰數(shù)目多，故選擇乙腈-1%乙酸水溶液為流動相；考察了235、254、275、280、320 nm五個檢測波長，發(fā)現(xiàn)在280 nm下，圖譜基線平穩(wěn)，色譜信息較為全面，故選擇280 nm作為檢測波長；考察了1.0 mL·min-1和0.6 mL·min-1兩個流速對色譜圖的影響，發(fā)現(xiàn)0.6 mL·min-1流速下分離效果更佳，故選擇0.6 mL·min-1作為最佳流速。

本實驗運(yùn)用相似度評價、主成分分析和聚類分析方法對當(dāng)歸不同干燥品HPLC指紋圖譜進(jìn)行分析。相似度分析結(jié)果顯示，各樣品間相似度均大于0.920，表明當(dāng)歸不同干燥品間相似度良好。主成分分析結(jié)果顯示60 ℃微波干燥、減壓干燥、60 ℃熱泵干燥樣品排名靠前，而評分較低的的幾批當(dāng)歸為曬干、陰干、熏干品。當(dāng)歸為油質(zhì)類藥材，減壓干燥能最大程度的減少干燥過程中化學(xué)成分的損失，傳統(tǒng)陰干、曬干、熏干品干燥時間長，干燥效率低，在長期干燥的過程中，伴隨失水其化學(xué)成分的含量明顯降低。本實驗結(jié)果排名靠前的樣品有60 ℃干燥品，跟相關(guān)文獻(xiàn)報道[13-14]有出入，基于此研究結(jié)果，可能的原因是高溫干燥下鮮藥材快速失水，致使藥材表面形成“硬皮”，藥材內(nèi)部失水變緩，化學(xué)成分損失亦減緩。

2015年版《中華人民共和國藥典》描述的當(dāng)歸干燥方法為熏干，歷史上鮮有本草記載以熏干為當(dāng)歸干燥方式。聚類分析發(fā)現(xiàn)，熏干樣品單獨聚為一類，其余干燥品聚為一類，說明傳統(tǒng)陰干、曬干和現(xiàn)代干燥方法得到的當(dāng)歸藥材質(zhì)量較為一致，可為現(xiàn)代干燥技術(shù)在當(dāng)歸藥材初加工的應(yīng)用提供一定科學(xué)依據(jù)。