郭龍，薛紫鯨，劉愛(ài)朋，張丹，鄭玉光*

1.河北中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，河北 石家莊 050200；2.河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050200

丹參為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根莖，味苦，微寒，歸心、肝經(jīng)。丹參具有通經(jīng)止痛、活血祛瘀、清心除煩、涼血消癰等功效，用于胸痹心痛、癥瘕積聚、熱痹疼痛、心煩不眠、月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)經(jīng)閉、瘡瘍腫痛[1]。丹參中的化學(xué)成分根據(jù)極性差異可以分為脂溶性成分和水溶性成分。脂溶性成分主要為丹參酮類化合物，如丹參酮IIA、隱丹參酮、丹參酮I和二氫丹參酮I等；水溶性成分主要為酚酸類化合物，如丹酚酸A、丹酚酸B和丹酚酸C等[2-3]。

丹參酮提取物為丹參的干燥根及根莖加工制成的提取物，主要含有脂溶性的丹參酮類成分[1，4]，收載于《中華人民共和國(guó)藥典》(2015版)。研究表明，丹參酮提取物具有抗氧化、抗炎、抗心肌缺血、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤等多方面的藥理活性，臨床中主要用于心腦血管疾病的治療[5-7]。丹參酮提取物主要含有脂溶性的丹參酮類成分，丹參酮類成分結(jié)構(gòu)相似、種類眾多，導(dǎo)致丹參酮提取物質(zhì)量控制較為困難。已有報(bào)道采用高效液相色譜法，以丹參酮IIA和隱丹參酮等成分為指標(biāo)，對(duì)丹參酮提取物質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)[8-9]，但這些方法存在著指標(biāo)成分過(guò)少，對(duì)照品消耗量大，操作復(fù)雜等缺陷。《中華人民共和國(guó)藥典》中以丹參酮IIA和隱丹參酮作為定性和定量指標(biāo)對(duì)丹參酮提取物進(jìn)行質(zhì)量控制，但除了上述有效成分之外，尚需建立更多活性成分如丹參酮I、二氫丹參酮I等的定量分析方法，以期對(duì)丹參酮提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行提高與完善。

中藥及其制劑具有“多成分、多靶點(diǎn)、整合作用”特點(diǎn)，決定了任何單一成分都難以準(zhǔn)確表達(dá)中藥及其制劑的整體質(zhì)量，因此，多指標(biāo)綜合質(zhì)量控制模式成為中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的發(fā)展趨勢(shì)[10-11]。但是，在實(shí)際工作中，標(biāo)準(zhǔn)品獲得的困難、單體不穩(wěn)定或價(jià)格昂貴等問(wèn)題成為了限制中藥多指標(biāo)質(zhì)量控制方法建立與推廣應(yīng)用的主要技術(shù)瓶頸。一測(cè)多評(píng)方法利用藥材各有效成分內(nèi)在函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系，達(dá)到測(cè)定一個(gè)易得標(biāo)準(zhǔn)品的含量，來(lái)實(shí)現(xiàn)多個(gè)成分含量同時(shí)測(cè)定的目的，可以較好解決標(biāo)準(zhǔn)品不易獲得的難題，在中藥及其制劑多成分、多指標(biāo)質(zhì)量控制中有廣泛應(yīng)用[12]。

綜上所述，本研究擬采用一測(cè)多評(píng)方法，建立丹參酮提取物中4種丹參酮類成分(丹參酮IIA、隱丹參酮、丹參酮I和二氫丹參酮I)的含量測(cè)定方法，以期為丹參酮提取多成分含量測(cè)定提供新方法，為丹參酮提取物的質(zhì)量控制提供更科學(xué)、更準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)模式。

1 材料

Aglient 1290液相色譜儀、Aglient 1260液相色譜儀(四元泵、DAD檢測(cè)器)；Shimadzu LC-20液相色譜儀(二元泵、紫外檢測(cè)器)；色譜柱：Aglient Extend C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，Therom BDS C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，Inerisil ODS-SP C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；Mettler-Toledo XS205 DU型電子分析天平；KS-5200B超聲波清洗儀(昆山潔立美超聲儀器有限公司)。

二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA(成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)分別為MUST-17032705、MUST-17030403、MUST-17030210、MUST-17022502)經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)，純度均大于98%(圖1)。丹參酮提取物(TE1～TE3)購(gòu)自于陜西天之潤(rùn)生物科技有限公司。乙腈和甲酸(ROE公司，色譜級(jí))；去離子水用Milli-Q系統(tǒng)制備；其他試劑均為分析純。

注：1.二氫丹參酮I；2.隱丹參酮；3.丹參酮I；4.丹參酮IIA。圖1 二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜分離采用Agilent Extend C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)；流速：0.8 mL·min-1；柱溫：25 ℃；梯度洗脫，洗脫程序：0～10 min，60%B；10～40 min，60%～80%B，保持80%B運(yùn)行5 min后，回到起始梯度，每次進(jìn)樣前以初始梯度平衡10 min；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm。上述色譜條件下，二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA 4個(gè)丹參酮類成分的分離度良好，色譜圖見(jiàn)圖2。

注：A.混合對(duì)照品；B.丹參酮提取物樣品；1.二氫丹參酮I；2.隱丹參酮；3.丹參酮I；4.丹參酮IIA。圖2 混合對(duì)照品和丹參酮提取物樣品HPLC圖

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取二氫丹參酮I 1.74 mg、隱丹參酮2.53 mg、丹參酮I 1.82 mg、丹參酮IIA 1.95 mg至25 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成含二氫丹參酮I 69.6 mg·L-1、隱丹參酮101.2 mg·L-1、丹參酮I 72.8 mg·L-1、丹參酮IIA 78 mg·L-1的混合對(duì)照品溶液，置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取丹參酮提取物粉末5 mg，加入1 mL甲醇，100 kHz超聲提取30 min，室溫下冷卻，加甲醇補(bǔ)足減少的質(zhì)量后，13 000 r·min-1離心10 min，取上清，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系、定量限及檢測(cè)限 將混合對(duì)照品溶液用甲醇稀釋成一系列的梯度濃度溶液后，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以待測(cè)化合物峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸，得到各成分標(biāo)準(zhǔn)曲線。在定量范圍內(nèi)各化合物的線性良好(r>0.999 7)，另以適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液逐級(jí)稀釋后進(jìn)樣分析，分別測(cè)定各待測(cè)成分信噪比(S/N為10和3時(shí)的濃度計(jì)為定量限和檢測(cè)限)，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 分別考察所建立的分析方法的日內(nèi)精密度和日間精密度。取丹參酮提取物樣品(TE1)，按2.3項(xiàng)下制備樣品，在一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄各個(gè)化合物的峰面積，計(jì)算RSD，考察日內(nèi)精密度；將上述樣品連續(xù)3 d每天進(jìn)樣3針，RSD，考察日間精密度。結(jié)果顯示，二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA的日內(nèi)精密度分別為0.45%、0.64%、0.50%、0.57%，日間精密度為0.92%、0.55%、0.43%、0.48%。由日內(nèi)、日間精密度考察結(jié)果可知，所建立分析方法的精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取丹參酮提取物(TE1)樣品粉末6份，每份5 mg，按2.3項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液。計(jì)算各化合物的含量，并計(jì)算測(cè)定結(jié)果的RSD。二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA的RSD分別為0.75%、0.95%、0.87%、0.91%，結(jié)果表明所建立的分析方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取丹參酮提取物(TE1)供試品溶液，于供試品溶液制備后0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣分析，記錄各化合物的峰面積并計(jì)算RSD，結(jié)果顯示，二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA峰面積的RSD分別為0.82%、0.87%、1.68%、0.18%。結(jié)果表明，所測(cè)定的4個(gè)丹參酮類成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定已知含量的丹參酮提取物(TE1)粉末5 mg，平行9份，分別加入4個(gè)丹參酮化合物對(duì)照品適量(高、中、低濃度各3份)，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，記錄各化合物的峰面積，計(jì)算各成分的含量。根據(jù)以下公式計(jì)算回收率。

(1)

4個(gè)丹參酮成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA的平均加樣回收率分別為100.67%、99.66%、100.82%、100.02%，RSD分別為3.49%、2.21%、2.93%、3.35%。加樣回收率結(jié)果表明，所建立的分析方法準(zhǔn)確性良好。

表1 4種丹參酮類成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、定量限和檢測(cè)限 mg·L-1

表2 4種丹參酮類成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.5 一測(cè)多評(píng)方法的建立

2.5.1 相對(duì)校正因子和相對(duì)保留時(shí)間的計(jì)算 化合物在一定范圍內(nèi)(線性范圍)成分的量(濃度)與紫外檢測(cè)器響應(yīng)成正比，在中藥多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)時(shí)，選取其中對(duì)照品易得、藥材中含量較高且穩(wěn)定的一個(gè)成分作為內(nèi)標(biāo)物，建立該內(nèi)標(biāo)物與其他待測(cè)成分之間的相對(duì)校正因子(RF)；在實(shí)際測(cè)定時(shí)，用外標(biāo)法測(cè)定內(nèi)標(biāo)物的含量，再通過(guò)相對(duì)校正因子計(jì)算其他待測(cè)組分的含量，從而實(shí)現(xiàn)只用一個(gè)對(duì)照品(內(nèi)標(biāo)物)，實(shí)現(xiàn)多個(gè)待測(cè)組分的含量測(cè)定[13]。

本實(shí)驗(yàn)中以丹參酮IIA為內(nèi)標(biāo)物，對(duì)丹參酮類化合物建立一測(cè)多評(píng)分析方法，各化合物的相對(duì)校正因子(RFX)根據(jù)以下公式計(jì)算：

(2)

其中Csi和Cxi分別表示內(nèi)標(biāo)化合物和待測(cè)化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg·g-1)，Rsi和Rxi表示內(nèi)標(biāo)化合物和待測(cè)化合物在對(duì)應(yīng)濃度下的響應(yīng)值，i為不同濃度梯度，每個(gè)化合物均在7個(gè)不同濃度下測(cè)試并計(jì)算，即n=7。

化合物的相對(duì)保留時(shí)間(RRT)可以用于樣品色譜圖中峰的標(biāo)定和指認(rèn)。化合物相對(duì)保留時(shí)間(RRTX)根據(jù)以下公式計(jì)算：

RRTX=RTX/RTS

(3)

其中RTX為待測(cè)化合物的保留時(shí)間(min)，RTS為內(nèi)標(biāo)化合物的保留時(shí)間(min)。

以丹參酮IIA為內(nèi)標(biāo)物，根據(jù)以上公式計(jì)算得二氫丹參酮I、隱丹參酮和丹參酮I的相對(duì)校正因子分別為1.55、1.12、1.28，相對(duì)保留時(shí)間分別為0.44、0.65、0.70。

2.5.2 系統(tǒng)耐用性考察 為了考察所建立一測(cè)多評(píng)方法的系統(tǒng)耐用性，針對(duì)不同色譜柱、不同色譜儀器、不同流速和不同柱溫等方面考察不同因素對(duì)于各化合物相對(duì)校正因子和相對(duì)保留時(shí)間的影響[14]。

不同儀器和不同色譜柱對(duì)RF和RRT的影響：選取3種色譜柱(Aglient Extend C18色譜柱、Therom BDS C18色譜柱和Inerisil ODS-SP色譜柱)和3種液相色譜系統(tǒng)(Aglient 1260液相色譜系統(tǒng)、Aglient 1290液相色譜系統(tǒng)和Shimadzu LC-20液相色譜系統(tǒng))對(duì)各丹參酮化合物的RF和RRT進(jìn)行了考察。結(jié)果表明(表3)，二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I的RF和RRT的RSD分別在2%～5%，表明所建立的一測(cè)多評(píng)方法具有良好的重復(fù)性和適應(yīng)性。

不同流速對(duì)RF和RRT的影響：采用Aglient 1260液相色譜系統(tǒng)和Agilent Extend C18色譜柱分別在不同流速(0.8、0.9、1、1.2 mL·min-1)下測(cè)定各化合物的RF和RRT。結(jié)果表明(表4)，在不同流速下二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I的RF和RRT重復(fù)性良好，RSD分別在0.64%～1.11%和1.90%～3.27%。

不同柱溫對(duì)RF和RRT的影響：采用Aglient 1260液相色譜系統(tǒng)和Agilent Extend C18色譜柱在不同柱溫(20、25、30 ℃)下測(cè)定各化合物的RF和RRT。結(jié)果顯示(表5)，不同柱溫對(duì)二氫丹參酮I、隱丹參酮和丹參酮I的RF和RRT影響較小，RSD分別在0.52%～0.98%和1.45%～2.44%。

由系統(tǒng)耐用性考察結(jié)果可知，二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I的RF和RRT受不同的色譜柱、不同液相色譜系統(tǒng)、不同流速和不同柱溫等因素的影響較小，所建立的一測(cè)多評(píng)方法系統(tǒng)耐用性良好。

表3 不同儀器和不同色譜柱測(cè)得的相對(duì)校正因子和相對(duì)保留時(shí)間

表4 不同流速下測(cè)得的相對(duì)校正因子和相對(duì)保留時(shí)間

表5 不同柱溫下測(cè)得的相對(duì)校正因子和相對(duì)保留時(shí)間

2.6 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法含量測(cè)定結(jié)果比較

經(jīng)方法學(xué)優(yōu)化和考察后，采用以上建立的一測(cè)多評(píng)方法，對(duì)3批丹參酮提取物(TE1～TE3)中的二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA 4個(gè)活性丹參酮類成分的含量進(jìn)行了測(cè)定。按照2.3項(xiàng)下方法制備丹參酮提取物樣品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，分別測(cè)定二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA的含量(圖2)。3批丹參酮提取物含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6，丹參酮類成分的總含量分別為23.64%、19.54%和19.14%。3批丹參酮提取物中，丹參酮IIA的含量均最高，分別為10.75%、10.79%和10.48%。

為了考察一測(cè)多評(píng)方法的準(zhǔn)確性，把一測(cè)多評(píng)法(SSDMC)的測(cè)定結(jié)果與外標(biāo)法(ESM)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了比較。以準(zhǔn)確度(Accuracy)來(lái)評(píng)價(jià)所建立的一測(cè)多評(píng)方法的可行性，準(zhǔn)確度由以下公式計(jì)算：

準(zhǔn)確度(%)=CS/CE×100%

(4)

其中，CS表示一測(cè)多評(píng)法計(jì)算所得的含量，CE表示通過(guò)外標(biāo)法計(jì)算所得的含量。

為了考察一測(cè)多評(píng)法的準(zhǔn)確性，比較了外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法的測(cè)定結(jié)果。采用一測(cè)多評(píng)法和傳統(tǒng)外標(biāo)法所測(cè)得的各成分的含量結(jié)果基本一致，通過(guò)t檢驗(yàn)對(duì)兩種方法測(cè)得的含量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。以上結(jié)果表明，以丹參酮IIA為內(nèi)標(biāo)物建立的一測(cè)多評(píng)方法具有較好的準(zhǔn)確性和可行性，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以用于丹參酮提取物的質(zhì)量控制。

表6 丹參酮提取物中4種丹參酮類成分一測(cè)多評(píng)法和外標(biāo)法含量測(cè)定結(jié)果(n=3) %

3 討論

在中藥多成分一測(cè)多評(píng)方法建立中，一般選取對(duì)照品易得、藥材中含量較高且穩(wěn)定的成分作為內(nèi)標(biāo)物。丹參酮IIA具有抗炎、抗氧化、抗心肌缺血、抗腫瘤等多種藥理活性，是丹參酮提取物中的主要活性成分之一[15]。丹參酮IIA對(duì)照品相對(duì)價(jià)廉易得，穩(wěn)定性較好，且在丹參酮提取物中含量較高，因此本實(shí)驗(yàn)中選擇丹參酮IIA為內(nèi)標(biāo)物，建立丹參酮提取物中4個(gè)主要活性丹參酮類成分的一測(cè)多評(píng)方法，用于丹參酮提取物的質(zhì)量控制。

為了確定一測(cè)多評(píng)方法的檢測(cè)波長(zhǎng)，采用DAD檢測(cè)器對(duì)4個(gè)丹參酮類化合物進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，各化合物的紫外吸收光譜見(jiàn)圖3。由結(jié)果可知，二氫丹參酮I、丹參酮I、隱丹參酮和丹參酮IIA最大吸收波長(zhǎng)分別為240、245、265、270 nm。因?yàn)閷?shí)驗(yàn)中選擇丹參酮IIA為內(nèi)標(biāo)化合物，因此將檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)為其最大吸收波長(zhǎng)270 nm。

為了獲得最好的色譜分離效果，分別對(duì)流速(0.8、0.9、1.0、1.2 mL·min-1)、柱溫(20、25、30 ℃)及流動(dòng)性pH(純水和0.1%甲酸)進(jìn)行了考察。最終確定最優(yōu)色譜條件為0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)；流速0.8 mL·min-1；柱溫30 ℃。

本實(shí)驗(yàn)中考察不同儀器、不同色譜柱、不同流速和不同柱溫等因素對(duì)相對(duì)校正因子和相對(duì)保留時(shí)間的影響，結(jié)果表明，不同儀器、不同色譜柱、不同流速和不同柱溫下測(cè)得各丹參酮類成分的相對(duì)校正因子和相對(duì)保留時(shí)間基本一致，相對(duì)校正因子的RSD小于2%，相對(duì)保留時(shí)間的RSD小于5%，說(shuō)明所建立的一測(cè)多評(píng)方法系統(tǒng)耐用性良好，可用于丹參酮提取物中4個(gè)丹參酮類成分的含量測(cè)定。

采用所建立的一測(cè)多評(píng)方法，以丹參酮IIA為內(nèi)標(biāo)物對(duì)3批丹參酮提取物的二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA4個(gè)丹參酮類成分的含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明，3批丹參酮提取物之間的質(zhì)量基本一致，差異不明顯。4個(gè)活性丹參酮類成分的總含量在19%～24%。為了進(jìn)一步考察所建立的一測(cè)多評(píng)方法的準(zhǔn)確性，將一測(cè)多評(píng)法的測(cè)定結(jié)果與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，兩種方法測(cè)定的結(jié)果基本一致，提示所建立的一測(cè)多評(píng)方法準(zhǔn)確度和可靠性良好，可用于丹參酮提取物的多成分含量測(cè)定及質(zhì)量控制。

注：A.二氫丹參酮I；B.隱丹參酮；C.丹參酮I；D.丹參酮IIA。圖3 二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA的紫外光譜圖

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立了以丹參酮IIA為內(nèi)標(biāo)物的丹參酮提取物的一測(cè)多評(píng)法，同時(shí)測(cè)定了丹參酮提取物中二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA的含量。所建立的方法具有較好的重復(fù)性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度，可用于丹參酮提取物的多成分含量測(cè)定及質(zhì)量控制。本研究提升了中華人民共和國(guó)藥典中丹參酮提取物的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，為其進(jìn)一步應(yīng)用和推廣提供了技術(shù)支撐。一測(cè)多評(píng)法作為一種全新的多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)模式，有助于解決中藥多成分質(zhì)量控制中對(duì)照品匱乏的瓶頸問(wèn)題，實(shí)際運(yùn)用具有較高的可行性、可推廣性。