王功帥，馬子清，潘鳳兵，田長平，陳 杰，王金政，陳學(xué)森，尹承苗*，毛志泉*

（1 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院/作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018；2 煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，山東煙臺(tái) 265500；3 臨沂市蘭山區(qū)園林辦公室，山東臨沂 276000；4 山東省果樹研究所，山東泰安 271018）

我國傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)栽培地區(qū)的蘋果園主要是上個(gè)世紀(jì)80年代與90年代初發(fā)展建立的，大部分已進(jìn)入衰老期，其中蘋果產(chǎn)區(qū)20年齡果園占20%，每年面臨2～3.33萬 hm2的老果園改造[1]，蘋果連作障礙是生產(chǎn)中的一大難題，給果農(nóng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約了我國果樹產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[2]。土壤pH失衡、自毒類物質(zhì)、土壤理化性質(zhì)惡化、微生物因素是引起蘋果連作障礙的主要因素[3-4]。蘋果連作障礙通常在再植后1～3年內(nèi)表現(xiàn)，具體表現(xiàn)為地上部發(fā)育不良，根系生物量降低，根尖壞死，嚴(yán)重的直接導(dǎo)致植株死亡[5-6]。

連作不僅抑制植物根系的生長，還嚴(yán)重影響對(duì)各種元素的吸收和積累。阮維斌等[7]研究表明，連作降低大豆植株對(duì)磷、鉀等礦質(zhì)元素的吸收，地上部分的養(yǎng)分比例下降。這可能由于連作提高根系超氧自由基和MDA水平，增加了膜滲透[8-9]，過多的自由基使線粒體膜流動(dòng)性降低[10]，膜通透性降低，功能喪失[11]。進(jìn)而破壞根系皮層和表皮層結(jié)構(gòu)[12]，影響根系功能。根系活力和根系質(zhì)膜ATPase活性是影響根系吸收功能的重要因子。質(zhì)膜H+-ATPase可利用ATP水解產(chǎn)生的能量將細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的H+泵到質(zhì)膜外側(cè)，產(chǎn)生跨膜pH梯度和跨膜電勢(shì)梯度[13-15]。此電化學(xué)梯度為物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)提供驅(qū)動(dòng)，帶動(dòng)一系列次級(jí)運(yùn)輸體系對(duì)各種營養(yǎng)物質(zhì)、離子的轉(zhuǎn)運(yùn)[15]。

氮素是果樹生長發(fā)育過程中所必需的重要營養(yǎng)元素，它影響果樹的營養(yǎng)生長和生殖生長，影響果樹內(nèi)各種生理生化過程。氮素的吸收直接關(guān)系到器官分化、形成以及樹體結(jié)構(gòu)的形成。由于15N標(biāo)記的特殊性，被廣泛應(yīng)用于植株體內(nèi)氮素的分配與積累研究上。然而關(guān)于蘋果連作條件下對(duì)氮元素的吸收、利用和分配鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)以盆栽平邑甜茶為試材，利用15N示蹤原子的方法，研究在連作條件下平邑甜茶對(duì)15N的吸收、利用和分配，進(jìn)一步揭示蘋果連作障礙的發(fā)生機(jī)制，為今后克服蘋果連作障礙提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)于2013年1—11月在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院國家蘋果中心實(shí)驗(yàn)站和國家蘋果實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。連作土取自山東省泰安市岱岳區(qū)滿莊鎮(zhèn)灘清灣村30年的老蘋果園，臨近老果園周圍的麥田土為正茬。連作土收集距樹干1 m、深5—40 cm范圍內(nèi)的土壤，多點(diǎn)取樣混勻使用。土壤類型為沙土，有機(jī)質(zhì)含量為5.04 g/kg，土壤硝態(tài)氮含量為13.2 mg/kg，銨態(tài)氮含量為4.11 mg/kg，速效鉀含量為109 mg/kg，速效磷含量為9.28 mg/kg，土壤pH為5.31。正茬土類型為沙土，有機(jī)質(zhì)含量為13.8 mg/kg，土壤硝態(tài)氮含量為15.3 mg/kg，銨態(tài)氮含量為9.37 mg/kg，速效鉀含量為122 mg/kg，速效磷含量為20.4 mg/kg，土壤pH為6.83。

試驗(yàn)材料選用平邑甜茶 (Malus hupehensis Rehd.)，2013年1月種子層積，待種子萌動(dòng)露白后即可在育苗盤中播種育苗。試驗(yàn)采用盆栽的方法，泥盆高26 cm，直徑28 cm，裝土7 kg，2013年5月選取生長一致的幼苗進(jìn)行移栽。

本試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理：T1為連作土溴甲烷滅菌處理；T2為連作土高溫滅菌處理；T3為老果園臨近麥田土；CK為連作土。每個(gè)處理重復(fù)20盆共計(jì)80盆。待盆栽幼樹長勢(shì)穩(wěn)定后，于2013年6月3日每盆施用0.5 g15N-尿素 (上海化工院生產(chǎn)，豐度為10.22%)，溶于水后均勻澆入盆內(nèi)。

1.2 測(cè)定方法

分別于8月5日和9月5日進(jìn)行破壞性取樣。植株材料用于生物量指標(biāo)、根系指標(biāo)和15N的測(cè)定；土壤樣品用于土壤微生物的測(cè)定。每個(gè)處理隨機(jī)選取3個(gè)重復(fù)。

生物量的測(cè)定：平邑甜茶幼苗株高和地徑分別用米尺和電子游標(biāo)卡尺測(cè)定，將當(dāng)天完整取樣的幼苗用去離子水沖洗干凈，晾干，用天平測(cè)定鮮重。將幼苗在105℃下高溫殺青30分鐘，80℃烘干至恒重為干重。

根形態(tài)測(cè)定：將不同處理的幼苗根剪下，用清水沖洗干凈，鋪展在水中，然后用專業(yè)版WinRHIZO(2007年版) 根系分析系統(tǒng)對(duì)樣品圖像進(jìn)行分析處理，記錄幼苗根系平均直徑、總體積、總表面積和根尖數(shù)等根系構(gòu)型參數(shù)。

根系活力的測(cè)定參照文獻(xiàn)[4]的方法。

根系質(zhì)膜H+-ATPase的測(cè)定參照文獻(xiàn)[16]的方法。

土壤微生物的測(cè)定：細(xì)菌的培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，真菌的培養(yǎng)采用馬丁氏培養(yǎng)基。

15N的測(cè)定：將樣品在105℃殺青30 min，80℃烘干，用不銹鋼電磨粉碎后過0.25 mm篩，樣品裝袋暫存待測(cè)。15N豐度及全15N含量在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院原子能研究所用MAT2251質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)計(jì)算與分析

肥料氮 (Ndff%) = (植物樣品中15N豐度%-自然豐度%) / (肥料中15N豐度% -自然豐度%) × 100

氮肥利用率 (%) =[Ndff% × 器官全氮量 (g)]/施肥量 (g) × 100

氮肥分配率 (%) = 各器官從氮肥中吸收的氮量(g) / 總吸收氮量 (g) × 100

從氮肥中吸收的氮量 (g) = 器官全氮量 (g) × Ndff%

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003進(jìn)行計(jì)算和作圖，通過SPSS 19.0軟件進(jìn)行Duncan顯著性檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 連作對(duì)平邑甜茶幼苗生物量的影響

由表1可以看出，連作顯著抑制了平邑甜茶幼苗生物量的生長。8月份，連作土溴甲烷熏蒸、高溫滅菌與麥田土處理幼苗的生物量沒有差異，但顯著高于連作土對(duì)照處理。連作土對(duì)照處理幼苗的鮮重分別為連作土溴甲烷、高溫滅菌處理和麥田土處理的56.15%、53.68%、68.22%，干重為溴甲烷、高溫滅菌處理和麥田土處理的52.17%、53.33%、66.67%。株高為溴甲烷、高溫滅菌處理和麥田土處理的54.77%、59.16%、68.89%。地徑為溴甲烷、高溫滅菌處理和麥田土處理的80.00%、80.00%、82.35%。9月份，除了地徑?jīng)]有差異外，連作土溴甲烷熏蒸、高溫滅菌處理和麥田土處理與連作處理相比幼苗株高、鮮重和干重達(dá)到顯著性差異。與溴甲烷熏蒸、高溫滅菌處理和麥田土處理相比，連作土對(duì)照處理的鮮重分別減少了46.77%、46.50%和27.38%；干重分別減少了50.57%、49.04%、39.56%；株高分別減少了41.97%、41.95%和23.51%。

表 1 不同處理平邑甜茶幼苗鮮重、干重及生長狀況Table 1 Effect of different treatments on the biomass of Malus hupehensis Rehd. seedlings

2.2 連作對(duì)平邑甜茶幼苗根系構(gòu)型的影響

由表2可知，與連作土處理相比，連作土溴甲烷熏蒸、高溫滅菌處理和麥田土處理幼苗根系結(jié)構(gòu)具有明顯的差別。連作土對(duì)照處理幼苗的根長、根面積、根尖數(shù)和分叉數(shù)顯著低于連作土溴甲烷熏蒸和高溫滅菌處理。8月份連作土處理的幼苗根長、根面積、根尖數(shù)和分叉數(shù)與麥田土處理沒有顯著性差異。隨著植株的生長，9月份測(cè)定結(jié)果表現(xiàn)為連作土處理的幼苗根長、根面積、根尖數(shù)和分叉數(shù)顯著低于連作土溴甲烷熏蒸、高溫滅菌和麥田土處理。與連作土溴甲烷熏蒸、高溫滅菌和麥田土處理相比，連作土處理的幼苗根長分別減少了60.10%、59.19%和42.35%；根面積分別減少了56.24%、55.75%和48.07；根尖數(shù)分別減少了30.29%、25.78%和25.94%；分叉數(shù)分別減少了94.13%、93.87%和93.06%。

2.3 連作對(duì)平邑甜茶根系活力的影響

圖1顯示，連作土處理的幼苗根系活力最低，顯著低于連作土溴甲烷熏蒸、高溫滅菌和麥田土處理。與連作土溴甲烷熏蒸、高溫滅菌和麥田土處理相比，8月連作土處理的幼苗根系活力分別減少了42.65%、43.09%和33.41%。而連作土溴甲烷熏蒸、高溫滅菌和麥田土處理無顯著差異。9月份麥田土處理幼苗根系活力顯著低于連作土溴甲烷熏蒸和高溫滅菌處理，高于連作土處理，與連作土溴甲烷熏蒸、高溫滅菌和麥田土處理相比，連作土處理的根系活力分別減少了39.71%、40.64%和26.80%。

2.4 連作對(duì)平邑甜茶幼苗根系質(zhì)膜H+-ATP酶的影響

通過測(cè)定H+-ATPase，發(fā)現(xiàn)連坐土溴甲烷熏蒸和高溫滅菌處理幼苗根系質(zhì)膜 H+-ATP 酶差異不大，但顯著高于麥田土和連作土，連作土幼苗根系活性最低，顯著低于麥田土。8月和9月趨勢(shì)基本一致，與溴甲烷熏蒸、高溫滅菌和麥田土處理相比，9月份連作土處理幼苗根系的H+-ATPase活性分別減少了41.44%、38.24% 和 25.78%(圖2)。

表 2 不同處理對(duì)平邑甜茶根系構(gòu)型的影響Table 2 Effect of different treatments on the root architecture of Malus hupehensis Rehd. seedlings

圖 1 不同處理對(duì)平邑甜茶幼苗根系活力的影響Fig. 1 Effects of different treatments on root activity ofMalus hupehensis Rehd. seedlings

2.5 連作對(duì)土壤微生物的影響

由表3可知，不同處理的土壤微生物數(shù)量差異很大。8月份，由于連作土溴甲烷熏蒸和高溫滅菌，土壤微生物總量顯著低于麥田土。連作土中細(xì)菌總量最少，顯著低于麥田土，真菌總量最高，與麥田土差異不大。隨著連作時(shí)間的延長，連作土壤微生物發(fā)生了顯著變化。9月份，連作土細(xì)菌總量顯著低于溴甲烷熏蒸、高溫滅菌和麥田土處理，分別占70.25%、37.13%、78.77%。連作土壤的真菌總量顯著高于溴甲烷熏蒸、高溫滅菌和麥田土處理，分別是其他3個(gè)處理的6.24倍、2.79倍、1.76倍。同時(shí)，細(xì)菌/真菌比值顯著低于溴甲烷熏蒸、高溫滅菌和麥田土處理。

圖 2 不同處理對(duì)平邑甜茶幼苗根系H+-ATPase的影響Fig. 2 Effect of different treatments on H+-ATPase activeof Malus hupehensis Rehd. seedlings

2.6 連作對(duì)15N-尿素的Ndff、分配率和利用率的影響

2.6.1 不同處理對(duì)植株各器官Ndff的影響 圖3可以看出，連作土處理各器官的Ndff最低，顯著低于連作土溴甲烷熏蒸、高溫滅菌和麥田土處理。8月份表現(xiàn)為隨著植株的生長，各器官的Ndff都增加，但是不同器官的Ndff含量發(fā)生了明顯變化。連作土溴甲烷熏蒸、高溫滅菌和麥田土處理莖葉的Ndff含量高于根系，而連作土處理幼苗根系的Ndff含量高于葉，莖最少。隨著15N的不斷消耗和植株的生長，在9月份連作土處理根莖葉器官的Ndff與其他3個(gè)處理的趨勢(shì)一致，莖 ＞ 根系 ＞ 葉。連作土處理根系的Ndff含量最低，與連作土溴甲烷熏蒸、高溫滅菌和麥田土處理相比，分別減少了18.26%、47.99%和46.78%；莖的Ndff含量分別減少了47.57%、46.75%和45.05%；葉片組織的Ndff含量分別減少了61.34%、58.65%和57.36%。

表 3 不同處理對(duì)土壤微生物的影響Table 3 Effect of different treatments on soil microbial amount

圖 3 不同處理對(duì)平邑甜茶各器官Ndff的影響Fig. 3 Effect of different treatments on the Ndff in organs of Malus hupehensis Rehd. seedlings

2.6.2 連作對(duì)植株各器官15N分配的影響 由圖4可知，不同處理平邑甜茶對(duì)15N營養(yǎng)元素在不同器官組織的分配有顯著的差異。連作土處理的根系和葉組織15N的分配與其他3個(gè)處理有顯著性差異。連作土幼苗根系15N分配率顯著高于連作土溴甲烷熏蒸、高溫滅菌和麥田土處理，而葉片15N的分配率顯著降低，而莖組織的15N分配基本無差異。8月份連作土處理根系15N的分配率為39.59%，分別是連作土溴甲烷熏蒸、高溫滅菌和麥田土的1.16、1.14、1.13倍。隨著植株的生長，9月份連作土處理根系15N的分配率有所提高，達(dá)到42.11%，是連作土溴甲烷熏蒸、高溫滅菌和麥田土處理的1.18倍。葉片組織的15N分配率顯著降低，由41.04%減少為29.55%。僅占連作土溴甲烷熏蒸、高溫滅菌和麥田土處理的64.78%、73.07%、59.93%。

2.6.3 連作對(duì)氮肥利用率的影響 圖5可以看出，連作土處理的氮肥利用率最低，顯著低于連作土溴甲烷熏蒸、高溫滅菌和麥田土處理。8月份連作土處理的氮肥利用率為11.0%，與連作土溴甲烷熏蒸、高溫滅菌和麥田土處理相比，分別減少了的61.75%、61.61%和47.68%。9月份連作土的氮肥利用率為13.33%，與其他3個(gè)處理相比，連作土處理分別減少了67.19%、67.68%和60.39%。

圖 4 不同處理對(duì)平邑甜茶15N分配的影響Fig. 4 Effect of different treatments on ratio of 15N partition of Malus hupehensis Rehd. seedlings

圖 5 不同處理對(duì)平邑甜茶氮肥利用率的影響Fig. 5 Effect of different treatments on itrogen fertilizer use efficiency of Malus hupehensis Rehd. seedlings

3 討論

生物因素是引起蘋果連作障礙的主要因素[3,17-18]。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，溴甲烷滅菌和高溫滅菌顯著提高了連作蘋果幼苗的生物量。土壤消毒處理克服了連作障礙的問題，進(jìn)一步表明有害微生物是引起蘋果連作障礙的主要原因，這與Yim等[12]研究結(jié)果一致。越來越多的研究表明有害真菌如Phytophthora、Pythium、Cylindrocarpon、Fusarium和Rhizoctonia的增加是引起蘋果連作障礙的重要因素[3,18-20]。Franke-Whittle等[21]采用高通量測(cè)序方法表明Acremonium、Cylindrocarpon和Fusarium的含量與蘋果植株生長呈明顯的負(fù)相關(guān)。病原真菌積累能顯著降低農(nóng)作物產(chǎn)量，增加病蟲害[22]。土壤微生物對(duì)土壤質(zhì)量有很大的影響，細(xì)菌型土壤是土壤肥力提高的生物學(xué)標(biāo)志之一，真菌型土壤是地力衰退的標(biāo)志[23]。試驗(yàn)表明，蘋果連作顯著增加了土壤中真菌的數(shù)量，并隨著連作時(shí)間的延長，土壤真菌數(shù)量越多。蘋果連作導(dǎo)致土壤由“細(xì)菌型”土壤向“真菌型”土壤轉(zhuǎn)變[24]。

根系作為植物吸收水分和養(yǎng)分的主要器官，可以通過其形態(tài)和分布來適應(yīng)外部環(huán)境的脅迫[25]。Bauerle等[26]研究表明，根系的快速生長與發(fā)達(dá)分生能力能夠抵御土壤中病原體。本試驗(yàn)結(jié)果表明，蘋果連作顯著抑制了根系的生長，導(dǎo)致根長、根面積、根尖數(shù)顯著低于正常水平。根系的生長狀況是影響果樹氮素吸收的關(guān)鍵因素。連作不僅抑制蘋果根系生長，還影響根系功能。連作會(huì)導(dǎo)致蘋果根系自由基大量產(chǎn)生，破壞了抗氧化酶系統(tǒng)和自由基之間的平衡[10,27]，過量的ROS會(huì)引起質(zhì)膜氧化損傷，破壞線粒體膜的完整性[27]。連作顯著降低了平邑甜茶的根系活力，降低了根系呼吸能力。ATPase是細(xì)胞質(zhì)膜重要的酶，H+-ATPase通過細(xì)胞膜運(yùn)輸系統(tǒng)進(jìn)行跨膜運(yùn)輸增加質(zhì)子電化學(xué)梯度進(jìn)而提高植物養(yǎng)分的吸收，連作脅迫顯著降低了質(zhì)膜H+-ATPase酶的活性，減少了根系功能所需要的能量，進(jìn)而影響了膜的功能，降低了根系對(duì)營養(yǎng)元素的吸收和運(yùn)輸。

根系吸收的氮素在樹體生長過程中起著重要的作用。隨著氣溫的增加和幼苗的快速生長，幼苗對(duì)15N的Ndff也不斷增加。然而，連作抑制了對(duì)15N的征調(diào)能力，降低各組織器官的Ndff，影響了不同器官的Ndff的含量。生長初期，連作條件下15N對(duì)莖的貢獻(xiàn)率最高，葉最低。生長快速期，15N對(duì)根系貢獻(xiàn)率最高，莖最少。說明更多的氮貢獻(xiàn)于根系，減少了植株地上組織生長的供應(yīng)。這與阮維斌等[7]研究結(jié)果一致。同時(shí)，連作還影響15N在不同組織器官的分配。試驗(yàn)結(jié)果表明根系中的15N分配越來越高，地上部分15N越來越少，并且隨時(shí)間的延長，根系對(duì)15N分配率有增長的趨勢(shì)。連作引起蘋果根系消耗更多的養(yǎng)分，這與Atucha等[28]研究結(jié)果一致。蘋果對(duì)氮肥利用率較低，一般為25%～35%[29]。本試驗(yàn)表明，在8月和9月，連作條件下蘋果幼苗的氮肥利用率分別為10.95%和13.33%，顯著低于正常水平，連作顯著抑制了根系對(duì)氮肥利用率。

4 結(jié)論

連作抑制了平邑甜茶幼苗根系生長和根系功能，降低了對(duì)氮肥的吸收，導(dǎo)致根系過多的消耗營養(yǎng)元素，減少了對(duì)地上部分的供應(yīng)，進(jìn)而影響植株的生長。因此，在防控蘋果連作障礙的措施中，應(yīng)注重選擇抗性和分生能力強(qiáng)的根系，加強(qiáng)根系防護(hù)，地上部分增加葉面施肥，緩解連作引起的地上部營養(yǎng)元素供應(yīng)不足。