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      鹽單胞菌S62 β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖的研究

      2019-04-09 12:30:48朱五二繆明永顧正華李由然丁重陽石貴陽
      生物加工過程 2019年2期
      關(guān)鍵詞:消耗率半乳糖乳糖

      朱五二,繆明永,顧正華,李由然,丁重陽,石貴陽

      (1. 江南大學(xué)生物工程學(xué)院糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫214122; 2. 江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫214122; 3. 第二軍醫(yī)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,上海200433)

      β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)俗稱乳糖酶(lactase),屬于糖基水解酶類(glycosyl hydrolases),可以水解β-1,4-糖苷鍵,同時(shí)還具有半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶活性[1],用于功能性食品低聚半乳糖(GOS)的合成。β-半乳糖苷酶廣泛存在于微生物(細(xì)菌、真菌和酵母)、植物(尤其是杏仁、桃、杏和蘋果)和動(dòng)物器官中[2-4]。微生物酶具有較高的生產(chǎn)力,能降低生產(chǎn)成本。目前已有古細(xì)菌、細(xì)菌、真菌和酵母的β-半乳糖苷酶研究報(bào)道[5],從真菌(米曲霉和黑曲霉)和酵母(乳酸克魯維酵母和脆弱克魯維酵母)獲得的酶顯示出巨大的商業(yè)潛力,來自乳酸克魯維酵母的β-半乳糖苷酶是使用最廣泛的酶之一[6-9]。

      低聚半乳糖是以乳糖作為供體和受體底物,利用β-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)糖基化活性產(chǎn)生的具有高達(dá)9聚合度(DP)的寡糖混合物[9],主要結(jié)構(gòu)由葡萄糖末端連接可變數(shù)目的半乳糖單元組成,半乳糖單元的數(shù)目通常為2~5[10],半乳糖單元通過β(1→3),β(1→6)和β(1→4)鍵連接,而半乳糖-葡萄糖鍵在大多數(shù)情況下是β(1→4)[11]。不同來源的酶合成低聚半乳糖是有差異的,其中低聚半乳糖主要包含三糖、四糖、五糖,以及異乳糖和半乳二糖[12]。

      低聚半乳糖是一種調(diào)節(jié)結(jié)腸微生物菌群的益生元,具有改善礦物質(zhì)吸收和預(yù)防結(jié)腸癌的功效[13]。研究表明,低聚半乳糖大大增加了雙歧桿菌的數(shù)量及其在腸道中的代謝活性[14-16],可降低過敏發(fā)生率[17-18]和病原體的黏附[15,18-19],并且能介導(dǎo)腸道免疫系統(tǒng)。此外,低聚半乳糖有效治療代謝性疾病[20]。因此,低聚半乳糖廣泛應(yīng)用在飲料和嬰兒奶粉的配方中[21]。

      我國目前仍存在β-半乳糖苷酶產(chǎn)量低的問題,從而限制了β-半乳糖苷酶在工業(yè)中的應(yīng)用。如何尋找一種高產(chǎn)、高酶活的β-半乳糖苷酶仍是國內(nèi)研究的難點(diǎn)。繆明永課題組的Wang等[22]對(duì)中國東海海水和海泥來源的海洋微生物進(jìn)行篩選,獲得了1株產(chǎn)S62β-半乳糖苷酶的鹽單胞菌S62(Halomonassp. S62),并對(duì)其低溫β-半乳糖苷酶基因(GenBank登錄號(hào)JQ337961)進(jìn)行了重組表達(dá)研究。

      在以上基礎(chǔ)上,筆者對(duì)S62β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖的反應(yīng)條件進(jìn)行探索,以獲得最大低聚半乳糖產(chǎn)率,以期為利用低溫β-半乳糖苷酶進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)低聚半乳糖提供重要的理論依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 試劑與儀器

      一水合乳糖、葡萄糖、半乳糖,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙腈,TEDIA公司。

      電熱恒溫水浴鍋,上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠;超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(UPLC-Q-TOF-MS)、高效液相色譜儀(HPLC),美國Waters公司。

      1.2 低聚半乳糖的檢測

      1.2.1 低聚半乳糖種類檢測

      采用 Waters Acquity BEH Amide柱(2.1 mm × 100 mm,1.7 μm)分離,質(zhì)譜檢測器,時(shí)間為20 min。流動(dòng)相A相:80%乙腈加0.1%氨水;B相:30%乙腈加0.1%氨水。柱溫45 ℃,流速0.3 mL/min,進(jìn)樣量1 μL。線性梯度洗脫程序見表1。

      表1 LC-MS洗脫條件

      注:質(zhì)譜離子化方式為負(fù)離子(ESI-),毛細(xì)管電壓為3.5 kV,錐孔電壓為20 V,脫溶劑氣溫度為400 ℃,脫溶劑氣流速為700 L/h,碰撞能量為6 eV,質(zhì)量范圍為10~1 000,檢測電壓為1 800 V。二級(jí)質(zhì)譜碰撞能量為6 eV,錐孔電壓為50 V,選擇離子質(zhì)荷比為341、503、665。

      1.2.2 低聚半乳糖含量的檢測

      實(shí)驗(yàn)采用雙柱法檢測[23-24],并計(jì)算低聚半乳糖含量。

      葡萄糖和半乳糖檢測:用伯樂公司的Aminex HPX-87C柱(300 mm×7.8 mm,9 μm)測出葡萄糖和半乳糖含量,流動(dòng)相為純水,檢測器為示差檢測器,流速為0.6 mL/min,柱溫為50 ℃,檢測器靈敏度為8,檢測器溫度為30 ℃,進(jìn)樣量為20 μL。

      乳糖檢測:使用Waters公司的Amide柱(4.6 mm × 250 mm,5 μm)測出乳糖含量,流動(dòng)相為70%乙腈,檢測器為示差檢測器,流速為1.0 mL/min,柱溫為40 ℃,檢測器靈敏度為8,檢測器溫度為30 ℃,進(jìn)樣量為20 μL。

      低聚半乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算見式(1)。

      w(GOS)=w(Lac)-w1(Gal)-w1(Glu)-
      w(H+)-w1(Lac)

      (1)

      式中:w1(Gal)=w(Gal)×(180-17)/180;

      w1(Glu)=w(Glu)×(180-1)/180;

      w(H+)=[n(Glu)-n(Gal)]×1。

      w(Gal)、w(Glu)、w(Lac)、w1(Lac)分別為水解半乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、水解葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、初始乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、反應(yīng)后乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù);n(Glu)、n(Gal)分別為葡萄糖和半乳糖的摩爾數(shù)。

      乳糖消耗率和低聚半乳糖產(chǎn)率的計(jì)算見式(2)和(3)。

      乳糖消耗率=w1(Lac)/w(Lac)×100%

      (2)

      低聚半乳糖產(chǎn)率=w(GOS)/w(Lac)×100%

      (3)

      1.3 單因素條件優(yōu)化

      1.3.1 pH對(duì)低聚半乳糖合成的研究

      用磷酸緩沖液配制pH為6.0~8.0的乳糖溶液,質(zhì)量濃度為250 g/L,用純水配制酶液600 U/mL,取1.9 mL乳糖溶液加入0.1 mL酶,在30 ℃下反應(yīng)6 h。計(jì)算出低聚半乳糖產(chǎn)率及乳糖消耗率。

      1.3.2 底物濃度對(duì)低聚半乳糖合成的研究

      采用單一變量法控制反應(yīng),底物質(zhì)量濃度為150~350 g/L,pH為7.0,其他條件如1.3.1節(jié)所述。計(jì)算出低聚半乳糖產(chǎn)率及乳糖消耗率。

      1.3.3 溫度對(duì)低聚半乳糖合成的研究

      采用單一變量法控制反應(yīng),反應(yīng)溫度為25~45 ℃,pH為7.0,其他條件如1.3.1節(jié)所述。計(jì)算出低聚半乳糖產(chǎn)率及乳糖消耗率。

      1.3.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)低聚半乳糖合成的研究

      采用單一變量法控制反應(yīng),反應(yīng)時(shí)間為4~12 h,pH為7.0,其他條件如1.3.1節(jié)所述。計(jì)算出低聚半乳糖產(chǎn)率及乳糖消耗率。

      1.3.5 加酶量對(duì)低聚半乳糖合成的研究

      采用單一變量法控制反應(yīng),加酶量為15~75 U/mL,pH為7.0,其他條件如1.3.1節(jié)所述,計(jì)算出低聚半乳糖產(chǎn)率及乳糖消耗率。

      1.4 低聚半乳糖合成正交試驗(yàn)

      在前期的基礎(chǔ)上,控制反應(yīng)時(shí)間為4 h,以溫度、底物濃度、pH、加酶量為考察因素,以低聚半乳糖含量為指標(biāo),進(jìn)行L9(34)的正交試驗(yàn)。

      1.5 最適條件低聚半乳糖合成及酶穩(wěn)定性

      在正交最適條件下進(jìn)行反應(yīng)8 h,定時(shí)取樣,使用HPLC測糖組分,并測定40 ℃下酶的穩(wěn)定性。

      2 結(jié)果與討論

      2.1 低聚半乳糖種類鑒定

      通過液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)鑒定S62β-半乳糖苷酶合成低聚糖的種類,結(jié)果如圖1所示。

      由圖1可知:出峰時(shí)間8.71、9.17和9.72 min為3種二糖,其質(zhì)譜圖依次為b、c、d,分別為乳糖、異乳糖和半乳二糖;出峰時(shí)間11.30和12.25 min為2種低聚半乳三糖,質(zhì)譜圖為e、f;出峰時(shí)間13.51和14.23 min為2種低聚半乳四糖,質(zhì)譜圖為g、h。此前,Rodriguez-Colinas等[25]鑒定了來自乳酸克魯維酵母的β-半乳糖苷酶產(chǎn)生的低聚半乳糖混合物中的5種低聚半乳糖。Urrutia等[26]從米曲霉的β-半乳糖苷酶產(chǎn)生的低聚半乳糖混合物中發(fā)現(xiàn)了9個(gè)種類。Yanahira等[27]從環(huán)狀芽孢桿菌的β-半乳糖苷酶產(chǎn)物中分離出11種低聚半乳糖。S62β-半乳糖苷酶以乳糖為底物合成了6種低聚半乳糖,可以看出S62β-半乳糖苷酶同樣具有較高的轉(zhuǎn)糖基酶活。

      (a)—選擇離子色譜圖;(b)、(c)、(d)—二糖質(zhì)譜圖;(e)、(f)—三糖質(zhì)譜圖;(g)、(h)—四糖質(zhì)譜圖圖1 低聚半乳糖種類分析Fig.1 Analysis of types of GOS

      2.2 pH對(duì)低聚半乳糖合成的影響

      Torres等[5]總結(jié)了細(xì)菌β-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)最適pH為6.0~8.0。以磷酸鹽緩沖液控制反應(yīng)體系pH,考察pH對(duì)低聚半乳糖合成的影響,結(jié)果如圖2所示。

      由圖2可知:S62β-半乳糖苷酶在pH 6.0~8.0穩(wěn)定性較好,表現(xiàn)出較好的轉(zhuǎn)糖基作用,低聚半乳糖產(chǎn)率為26%~30%,乳糖轉(zhuǎn)化率為69%~75%,其中在pH為7.0時(shí),有最大低聚半乳糖產(chǎn)率(29.46±0.66)%,乳糖消耗率為(73.40±0.85)%。因此,在此反應(yīng)體系中,最適pH為7.0。

      2.3 底物濃度對(duì)低聚半乳糖合成的影響

      在乳糖存在時(shí),β-半乳糖苷酶存在著水解活性與轉(zhuǎn)糖基化活性相互競爭現(xiàn)象,即當(dāng)反應(yīng)開始時(shí),乳糖濃度較高,轉(zhuǎn)糖基作用占主導(dǎo)作用,但是隨著反應(yīng)進(jìn)行,水解活性逐漸增強(qiáng),最終生成葡萄糖和半乳糖[28]。由此可見高濃度的乳糖有利于低聚半乳糖的合成。因此,選擇150~350 g/L的乳糖,研究其對(duì)低聚半乳糖合成的影響,結(jié)果如圖3所示。

      由圖3可知:當(dāng)乳糖質(zhì)量濃度大于200 g/L時(shí),乳糖轉(zhuǎn)化率隨著底物濃度的增加逐漸降低,其原因主要是在一定的反應(yīng)時(shí)間內(nèi),底物過飽和,酶結(jié)合底物能力有限,進(jìn)而轉(zhuǎn)化率下降;而底物質(zhì)量濃度為150 g/L時(shí),底物濃度降低,酶水解活性增強(qiáng),導(dǎo)致乳糖和低聚半乳糖被降解為葡萄糖和半乳糖。所以當(dāng)酶量為30 U/mL,反應(yīng)時(shí)間為6 h,底物質(zhì)量濃度為200 g/L,其低聚半乳糖產(chǎn)率為(26.57±0.36)%,乳糖消耗率最高為(67.40±0.55)%。

      2.4 溫度對(duì)低聚半乳糖合成的影響

      低溫酶在低溫條件下通常保留著較高的酶活。Fan等[29]等研究了來自Rahnellasp. R3的低溫β-半乳糖苷酶,以乳糖為底物,在4~35 ℃的寬溫度范圍內(nèi)顯示高活性;Coker[30]報(bào)道了AntarcticArthrobacterβ-半乳糖苷酶以乳糖為底物時(shí)最適為15~20 ℃。筆者研究了溫度對(duì)低聚半乳糖合成的影響,結(jié)果如圖4所示。

      由圖4可知:乳糖存在時(shí),S62β-半乳糖苷酶同樣在25~45 ℃時(shí),表現(xiàn)出較高的酶活,最適轉(zhuǎn)糖基化溫度為40 ℃,此時(shí)低聚半乳糖產(chǎn)率為(36.15±0.01)%,乳糖消耗率為(82.45±0.01)%。溫度過高時(shí),S62β-半乳糖苷酶在較短的時(shí)間內(nèi)失活,導(dǎo)致溫度為45 ℃時(shí)的酶活比40 ℃時(shí)的酶活下降明顯。

      圖2 pH對(duì)低聚半乳糖合成的影響Fig.2 Effects of pH on GOS synthesis

      圖3 乳糖濃度對(duì)低聚半乳糖合成的影響Fig.3 Effects of lactose concentration on GOS synthesis

      圖4 溫度對(duì)低聚半乳糖合成的影響Fig.4 Effects of temperature on GOS synthesis

      2.5 加酶量對(duì)低聚半乳糖合成的影響

      在酶催化過程中為了保證底物高效利用以及產(chǎn)物高得率,酶用量適當(dāng)是關(guān)鍵因素。S62β-半乳糖苷酶加酶量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

      由圖5可知:當(dāng)加酶量為15 U/mL時(shí),加酶量低,轉(zhuǎn)化效率不高,乳糖消耗率和低聚半乳糖產(chǎn)率都最低;當(dāng)加酶量為75 U/mL時(shí),加酶量高,在6 h內(nèi)反應(yīng)速度過快,乳糖消耗率最高,但低聚半乳糖產(chǎn)率降低,此時(shí)低聚半乳糖更多的被降解。所以在此反應(yīng)體系中,S62β-半乳糖苷酶最適加酶量為60 U/mL,此時(shí)乳糖消耗率為(82.51±0.79)%,GOS轉(zhuǎn)化率為(33.88±0.01)%。

      圖5 加酶量對(duì)低聚半乳糖合成的影響Fig.5 Effects of enzyme amount on GOS synthesis

      2.6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)低聚半乳糖合成的影響

      β-半乳糖苷酶反應(yīng)工藝中要求的是高效高產(chǎn)低耗,所以反應(yīng)時(shí)間的控制有利于提高工藝效率。S62β-半乳糖苷酶的反應(yīng)時(shí)間對(duì)合成的影響結(jié)果如圖6所示。

      由圖6可知:乳糖消耗率隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而增加,但低聚半乳糖產(chǎn)率先增加后降低,在反應(yīng)時(shí)間為10 h時(shí),低聚半乳糖產(chǎn)率達(dá)到最大值,為(33.1±0.32)%,乳糖消耗率為(77.87±0.28)%。

      圖6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)低聚糖合成的影響Fig.6 Effects of time on the GOS synthesis

      2.7 低聚半乳糖合成正交試驗(yàn)

      在以上的單因素條件基礎(chǔ)上,設(shè)定反應(yīng)時(shí)間為4 h,以底物濃度、反應(yīng)溫度、加酶量、pH為考察對(duì)象,設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)表如表2所示,試驗(yàn)結(jié)果和結(jié)果分析如表3和表4所示。

      表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

      表3 正交試驗(yàn)結(jié)果表

      表4 結(jié)果分析表

      由表2~4可知:最適反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度40 ℃、底物質(zhì)量濃度300 g/L、反應(yīng)pH 7.0、加酶量50 U/mL,得到最高低聚半乳糖產(chǎn)率為(37.87±0.11)%,此時(shí)乳糖消耗率為(75.90±0.43)%。不同因素對(duì)低聚半乳糖產(chǎn)率的影響順序從大到小依次為底物濃度、加酶量、pH、溫度。

      2.8 低聚半乳糖合成最適條件

      在上述正交試驗(yàn)結(jié)果的最優(yōu)反應(yīng)體系下,每隔1 h取樣1次,結(jié)果如圖7所示。

      由圖7可知:低聚半乳糖產(chǎn)率和乳糖降解率隨著反應(yīng)時(shí)間的延長而增加,在4~8 h內(nèi),低聚半乳糖產(chǎn)率都維持在40%,在反應(yīng)6 h時(shí)可獲得最大低聚半乳糖產(chǎn)率(41.91±0.27)%,乳糖消耗率為(82.47±0.38)%。

      目前,大部分β-半乳糖苷酶用于合成低聚半乳糖時(shí),乳糖的高效利用率和低聚半乳糖高產(chǎn)率無法兼得。Aburto等[11]對(duì)米曲霉β-半乳糖苷酶進(jìn)行了研究,在其最優(yōu)反應(yīng)體系中,低聚半乳糖產(chǎn)率為40%,40.3%的乳糖發(fā)生轉(zhuǎn)化,但其乳糖利用率不高。Geiger等[31]報(bào)道了嗜熱鏈球菌β-半乳糖苷酶在37 ℃、80%乳糖轉(zhuǎn)化時(shí),低聚半乳糖產(chǎn)率達(dá)到總糖含量的34.2%;在94%~95%的乳糖轉(zhuǎn)化率下,低聚半乳糖產(chǎn)率降低至30%,乳糖利用率高,但低聚半乳糖產(chǎn)率低。Vasiljevic等[32]報(bào)道了保加利亞乳桿菌的β-半乳糖苷酶以質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的乳糖為底物,在50 ℃下獲得最佳的低聚半乳糖產(chǎn)量,為20%。而本研究中的S62β-半乳糖苷酶在乳糖轉(zhuǎn)化率接近90%時(shí),反應(yīng)4~6 h時(shí),低聚半乳糖產(chǎn)率始終可保持40%以上,所以S62β-半乳糖苷酶可以在較長的時(shí)間內(nèi)維持高低聚半乳糖產(chǎn)量。

      對(duì)40 ℃下S62β-半乳糖苷酶剩余酶活進(jìn)行檢測,8 h時(shí)酶活僅剩60%左右。由于S62β-半乳糖苷酶屬于低溫酶,溫度高時(shí),酶的半衰期短,后期酶活降低,減慢了低聚半乳糖的水解,這也可能是低聚半乳糖產(chǎn)率在長時(shí)間內(nèi)維持在40%以上的原因之一。

      圖7 最適條件反應(yīng)結(jié)果及剩余酶活變化Fig.7 Optimum reaction conditions and the remaining changes of enzyme activity

      3 結(jié)論

      筆者對(duì)S62β-半乳糖苷酶產(chǎn)低聚半乳糖工藝進(jìn)行了研究,反應(yīng)體系為1.9 mL反應(yīng)液,0.1 mL酶液,得到最適產(chǎn)低聚半乳糖條件如下:反應(yīng)溫度40 ℃、底物質(zhì)量濃度300 g/L、反應(yīng)pH 7.0、加酶量50 U/mL,反應(yīng)6 h時(shí)可獲得最大低聚半乳糖產(chǎn)率(41.91±0.27)%,此時(shí)乳糖消耗率為(82.47±0.38)%。反應(yīng)4~8 h內(nèi),低聚半乳糖產(chǎn)率均維持在40%以上。而在本實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)乳糖轉(zhuǎn)化率接近90%時(shí),低聚半乳糖產(chǎn)率仍可維持在40%左右,即乳糖轉(zhuǎn)化率與低聚半乳糖產(chǎn)率均可維持在較高水平,不僅獲得了高附加值的產(chǎn)物,也在一定程度上提高了原料的利用率,這可為后續(xù)的S62β-半乳糖苷酶工藝應(yīng)用提供技術(shù)參考,同時(shí)也有利于低聚半乳糖的工業(yè)化生產(chǎn)。

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