吳 濤, 陳少瑜,3, 寧德魯, 肖良俊, 賀 娜, 唐春云, 和玉德

(1.云南省林業(yè)科學(xué)院，云南 昆明650201；2.云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點實驗室，云南 昆明650201；3.云南省木本油料工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650201；4.怒江州木本油料產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究所， 云南 瀘水 673199；5.怒江州林業(yè)科學(xué)研究所，云南 瀘水 673199)

我國現(xiàn)有核桃屬(Juglans)植物8種，作為堅果栽培的有2種，包括核桃(Juglansregia)和深紋核桃(泡核桃、云南核桃)(Juglanssigillata).核桃適應(yīng)性較強、分布廣泛，主要栽培于山西、河北、新疆等北方地區(qū)，是核桃屬中栽培最廣的樹種.深紋核桃是我國的特有種，主要分布在我國西南地區(qū)(云南、貴州、四川西部、西藏南部最為集中)[1]，也是云南的主要栽培種.怒江傈僳族自治州地處橫斷山三江并流核心區(qū)，屬青藏高原和橫斷山脈的過度地帶.特殊的自然地理環(huán)境和立體氣候，為動植物的生長提供了多樣的大環(huán)境與異常豐富的小環(huán)境，是全球生物資源最富集的地區(qū)之一[2].作為深紋核桃的自然分布區(qū)，該區(qū)域也蘊育了豐富的核桃種質(zhì)資源，初步調(diào)查發(fā)現(xiàn)該區(qū)域現(xiàn)保存有一定規(guī)模的深紋核桃天然群體和數(shù)量可觀的實生群體，這些豐富和多樣的資源將為核桃育種以及資源開發(fā)和利用提供物質(zhì)基礎(chǔ).但對現(xiàn)有核桃種質(zhì)資源遺傳背景、親緣關(guān)系缺乏深入系統(tǒng)的了解使得進一步的育種工作受到很大限制.對核桃種質(zhì)資源，尤其是野生資源進行遺傳多樣性分析和評價，可為核桃資源的保護利用提供可靠的理論依據(jù)，也可為核桃遺傳育種及遺傳規(guī)律的研究奠定基礎(chǔ).

DNA分子標記技術(shù)是當(dāng)前植物資源遺傳多樣性評價的強有力工具，尤其是基于PCR基礎(chǔ)的分子標記已廣泛應(yīng)用在植物遺傳多樣性分析[3].近年來，國內(nèi)外采用隨機擴增多態(tài)性DNA(random amplification polymorphism DNA, RAPD)，簡單重復(fù)序列間擴增(inter-simple sequence repeats, ISSR)，簡單序列重復(fù)長度多態(tài)性(simple sequence repeats, SSR)，擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphis, AFLP)等分子標記技術(shù)對核桃種質(zhì)資源進行遺傳多樣性研究[4-9],為核桃種質(zhì)資源利用及保存提供技術(shù)支撐.SSR分子標記技術(shù)是以PCR為基礎(chǔ)的DNA多態(tài)性檢測技術(shù)，具有穩(wěn)定、共顯性和信息量大等優(yōu)點，被廣泛地應(yīng)用于核桃種質(zhì)鑒定和居群遺傳特點的研究中[10].本課題組在深紋核桃SSR標記開發(fā)及云南省核桃種質(zhì)資源調(diào)查基礎(chǔ)上，對怒江州豐富的核桃種質(zhì)資源進行遺傳多樣性研究，揭示其遺傳多樣性水平及遺傳結(jié)構(gòu)狀況，為資源的利用和保護提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況及材料來源

怒江傈僳族自治州位于云南省西北部(25°33′—28°23′N, 98°09′—99°39′E)，怒江中游.總面積14 703 km2，州內(nèi)最低海拔738 m，最高海拔5 128 m，年均溫度11～20 ℃，年均降雨量1 000～1 700 mm.怒江州屬低緯高原季風(fēng)氣候，同時受地形地貌和緯度差異的影響，形成獨特的立體氣候.該區(qū)下轄貢山、福貢、瀘水和蘭坪4個縣，4個縣均有豐富的核桃資源分布.

根據(jù)當(dāng)?shù)亓謽I(yè)部門的相關(guān)資料及走訪當(dāng)?shù)厝罕姭@取的深紋核桃的資源信息，確定用以分析的資源.共采集122份深紋核桃資源樣品，每份資源相距至少100 m,分別采自怒江州的4個縣，4個核桃群體地理信息、樣本數(shù)列于表1.每份資源以采集的單株(二倍體)穗條作為1個樣本，穗條采回后取韌皮提取DNA.

表1 地理信息及樣本容量Table 1 Geographical information of sampling sites and sample sizes

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 采用改進CTAB法提取核桃穗條韌皮基因組DNA[11]，提取的DNA用瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合紫外可見分光光度計(Thermo Scientific)檢測濃度與純度，用Tris-EDTA緩沖液將樣品稀釋至20 ng·μL-1，-20 ℃保存?zhèn)溆?

1.2.2 SSR-PCR擴增及毛細管電泳 SSR-PCR反應(yīng)體系及擴增程序參照陳少瑜等方法[12]，用20對多態(tài)性高且穩(wěn)定性好的SSR引物進行核桃種質(zhì)資源SSR-PCR擴增，20對引物信息見表2.毛細管電泳參照Chen et al的法[10].

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

用GenAIEx 6.5軟件計算等位基因數(shù)，用POPGENE version 1.32軟件分析群體遺傳多樣性參數(shù)[13]，包括多態(tài)位點百分率(percentage of polymorphic bands, PPB)、觀察等位基因數(shù)(observed number of alleles,Na)、有效等位基因數(shù)(effective number of alleles,Ne)、觀察雜合度(obseved heterozygosity,Ho)、期望雜合度(expected heterozygosity,He)、Shannon信息指數(shù)(Shannon′s information index,I)、Nei′s遺傳多樣性指數(shù)(Nei′s gene diversity,H)、群體間的遺傳距離(genetic distance,D)和遺傳一致度(genetic identity,I).

表2 20對SSR引物信息及擴增片段Table 2 Profiles of 20 SSR primers and amplified fragments

用POPGENE version 1.32軟件獲得群體遺傳分化狀況參數(shù)，包括群體內(nèi)繁育系數(shù)(inbreeding coefficient at the population level,FIS)、總?cè)后w內(nèi)繁育系數(shù)(inbreeding coefficient at the total sample level,FIT)、群體分化系數(shù)(proportion of differentiation among populations,FST)[14]以及反映基因流強度的群體每代遷移數(shù)(gene flow,Nm)[15].基于4個群體的遺傳一致度，運用Mega 6.06軟件進行UPGMA聚類并繪制各群體遺傳關(guān)系樹狀圖[16].用Mantel檢驗估算群體間遺傳距離和地理距離的相關(guān)性[17].

2 結(jié)果與分析

2.1 怒江州核桃種質(zhì)資源的遺傳多樣性

將篩選出的穩(wěn)定性強、多態(tài)性高的20對SSR引物用于怒江州4個群體122份核桃種質(zhì)資源的SSR擴增，擴增片段大小在96～250 bp之間.共檢測到等位基因184個，平均為10.82個.擴增結(jié)果經(jīng)POPGENE version 1.32軟件分析得到4個群體的遺傳多樣性參數(shù)(表3).

表3 怒江州4個核桃群體的遺傳多樣性參數(shù)1)Table 3 Genetic diversity parameters of 4 J.sigillata populations

1)Na：觀察等位基因數(shù)；Ne：有效等位基因數(shù)；Ho：觀察雜合度；He：期望雜合度；I：Shannon信息指數(shù)；H：Nei′基因多樣性指數(shù).

由表3可得，4個群體的多樣性參數(shù)存在明顯差異，其中蘭坪群體的有效等位基因數(shù)、期望雜合度、Shannon信息指數(shù)和Nei′基因多樣性指數(shù)在所有群體中最高，分別是3.42、0.650、1.365和0.641；而瀘水群體的各參數(shù)最低，分別是2.41、0.503、0.937和0.485.因此，怒江州4個核桃群體中蘭坪群體的遺傳多樣性相對較高，瀘水群體的遺傳多樣性相對較低.

Nei′s基因多樣性指數(shù)及Shannon′s信息指數(shù)可以有效反映群體的遺傳多樣性[18]，期望雜合度是反映種質(zhì)資源遺傳多樣性的重要參考指標[19]，其中期望雜合度不僅是衡量群體遺傳多樣性最常用的指標，同時也反映群體中等位基因的豐富度和均勻程度[7].本研究結(jié)果Nei′基因多樣性指數(shù)平均為0.576，Shannon信息指數(shù)平均為1.157，期望雜合度平均為0.591，與相關(guān)采用SSR分子標記的核桃相比(表4)，怒江州深紋核桃種質(zhì)資源的遺傳多樣性屬于中等水平.

表4 核桃屬植物SSR標記的遺傳多樣性參數(shù)比較Table 4 Comparison on genetic parameters of walnut populations based on SSR

2.2 怒江州核桃種質(zhì)資源的遺傳分化

怒江州核桃群體間遺傳分化狀況詳見表5.由表可知，群體間的近交系數(shù)介于-0.109 6～0.690 5之間，平均為0.244 6，其中3個位點(JSI-63，JSI-15和ZMZ11)的雜合子過剩.群體間的遺傳分化系數(shù)介于0.027 1～0.126 4之間，平均為0.060 9，表明遺傳變異主要存在于群體內(nèi)，只有6.09%的遺傳變異來源于群體間.各位點的基因流(Nm)差異較大，變化范圍在1.727 2～8.992 0之間，平均為3.858 3.

2.3 群體的遺傳關(guān)系及聚類分析

4個核桃群體間Nei′s遺傳距離D值的變化范圍為0.083 6～0.164 6(表6).其中蘭坪群體和福貢群體的遺傳距離最小(0.083 6)；貢山群體和瀘水群體的遺傳距離最大(0.164 6).根據(jù)Nei′s遺傳一致度，構(gòu)建群體遺傳關(guān)系UPGMA聚類圖(圖1).從聚類圖可以看出，當(dāng)遺傳距離約為0.1時，4個群體聚成了3組，其中蘭坪和福貢聚為一組，貢山和瀘水分別為一組.

現(xiàn)階段我們國家對于稅源的管理不夠完善，征管措施比較落后，公民納稅意識比較薄弱，所以在政所的時候需要循序漸進，按照合理的征收過程，把現(xiàn)階段的分類稅制過渡到綜合分類稅制的形式，而且需要把綜合所得課稅為基礎(chǔ)，以分類所得稅當(dāng)作輔助內(nèi)容。進而將連續(xù)性較強以及經(jīng)營性的收入增加到綜合所得的征收項目里面，而且需要選擇累進稅率，按照所得比例進行征收。

利用Mantel檢驗計算種群的地理距離和遺傳距離相關(guān)性，當(dāng)P<0.05時，認為地理距離和遺傳距離具有顯著相關(guān)性.4個核桃群體Nei′s遺傳距離與地理距離的Mantel檢驗結(jié)果顯示群體間的遺傳距離與地理距離之間呈現(xiàn)顯著相關(guān)性(r=0.702 9，P=0.032 9).

3 小結(jié)與討論

3.1 群體的遺傳多樣性

研究表明，怒江州深紋核桃種質(zhì)資源的遺傳多樣性屬于中等水平，其中蘭坪群體的遺傳多樣性較高，瀘水群體的遺傳多樣性較低.

表5 怒江州核桃種質(zhì)資源的遺傳分化與基因流1)Table 5 Genetic differentiation and gene flow of 4 J.sigillata populations in Nujiang Prefecture

1)FIS：群體間的近交系數(shù)；FIT：總的群體間近交系數(shù)；FST：群體間的遺傳分化系數(shù)；Nm：基因流.

表6 怒江州4個核桃群體間Nei′s遺傳距離(D)與遺傳一致度(I)1)Table 6 Nei′s genetic distances and genetic identity among 4 populations

1)遺傳一致度(I)(對角線之上)，遺傳距離(D)(對角線之下).

圖1 基于Nei′s遺傳距離的UPGMA聚類圖Fig.1 Phylogenetic dendrogram based on genetic distance by UPGMA cluster

準確估算一個樹種在其分布區(qū)的遺傳多樣性對于基因保存和優(yōu)樹選擇非常重要[23]，而某一樹種的遺傳多樣性水平及分布格局是地理分布、繁育系統(tǒng)、人為影響等諸多因素共同作用的結(jié)果.影響遺傳多樣性的因素有繁育系統(tǒng)、遺傳漂變、基因突變和基因流等內(nèi)部因素，還包括由于環(huán)境變化和人為干擾引起的種群隔離、生境片斷化等外部因素[24].本研究中，怒江州復(fù)雜的地形地貌和多樣氣候環(huán)境是維持該區(qū)域核桃種質(zhì)資源多樣性的重要原因之一，其次核桃為同株異花、雌雄異熟的風(fēng)媒傳粉樹種，長期的自然演變和相互授粉，導(dǎo)致核桃群體高度雜合和較為復(fù)雜的遺傳背景，使核桃群體產(chǎn)生較高的遺傳多樣性.然而，另一方面，風(fēng)媒傳粉距離的限制，地理分布和人為活動導(dǎo)致的片段化又會導(dǎo)致一定水平的遺傳漂變[8]；同時，核桃作為重要的經(jīng)濟林樹種之一，人為干擾較大，諸如種質(zhì)的交換、良種的種植推廣、野生資源及其生境的破壞等致使多樣性降低，這些因素綜合作用的結(jié)果使得此區(qū)域核桃資源的遺傳多樣性僅處于中等水平.其中蘭坪群體具有相對較高的多樣性是由于收集的樣品數(shù)量較多，另外調(diào)查也發(fā)現(xiàn)蘭坪的野生資源較為豐富.

3.2 群體間的遺傳分化

4個群體的遺傳分化系數(shù)FST=0.060 9，表明僅有6.09%的遺傳變異來源于群體間，遺傳變異主要來自群體內(nèi)，群體內(nèi)的分化是該區(qū)域核桃種質(zhì)資源變異的主要途徑.此分化系數(shù)高于基于SSR標記的黑核桃居群(FST=0.017)[22]，低于西藏核桃居群(FST=0.103)和泡核桃居群(FST=0.111)[21]，也低于中國8個核桃居群(FST=0.196)[7]，說明該區(qū)域核桃群體間的遺傳分化水平較低.

基因流是影響群體內(nèi)部和群體之間遺傳變異程度的重要因素[25]，而群體的遺傳分化狀況又直接反映了群體的遺傳結(jié)構(gòu).基因流的大小可以反映群體遺傳分化的狀況.Hamrick et al[26]認為當(dāng)Nm>1時，基因流足以抵制遺傳漂變的作用，也可以防止群體間的分化；當(dāng)Nm<1時，遺傳漂變可導(dǎo)致明顯的群體間遺傳分化.怒江州4個核桃群體的平均Nm為3.858 3(Nm>1)，說明群體間的基因交流阻止了群體間的分化，這與陳良華等對四川核桃資源的遺傳多樣性研究結(jié)果相似[27].Nm水平主要與物種的繁殖方式、花粉和種子傳播方式、地理分布有關(guān)，也與環(huán)境變化或人為活動密切相關(guān).有研究表明，具有高度異交率的樹種Nm值較大，如冷杉、桉樹(Nm>5)[28].盡管核桃通過雌雄花的異熟性避免自交又是典型的風(fēng)媒傳粉，但研究表明核桃存在一定的自交現(xiàn)象[29]，風(fēng)媒花粉傳播距離有限，尤其對于分布于怒江山谷溝壑中的野生資源花粉的傳播受到地理隔離，因而核桃群體間的基因交流更可能是種子傳播造成的.人為馴化也是群體遺傳分化低下的重要原因[30].總之，怒江州為傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)區(qū)，核桃又是具有特殊經(jīng)濟價值的樹種，受人為影響較大，人為實生選種、種子的交換加強了群體間的基因交流，降低了群體間的遺傳分化.

基于遺傳距離的UPGMA聚類表明，聚類結(jié)果與群體的地理位置和距離有顯著關(guān)系.首先，同屬怒江中游，而且地理距離相對近的蘭坪和福貢群體聚為一組；然后與怒江下游地理距離相對較遠的瀘水群體聚類，最后再與怒江上游、地理距離最遠的貢山聚類.蘭坪、福貢和瀘水位于怒江中下游，三者與上游的貢山間分布有怒江大峽谷，一定程度上阻隔了基因流動.4個群體的地理分布特點導(dǎo)致了其特有的遺傳結(jié)構(gòu)和聚類結(jié)果.

3.3 怒江州核桃種質(zhì)資源的保護及利用

遺傳多樣性是資源利用的基礎(chǔ)，應(yīng)重視對它的保護和利用.4個群體中，蘭坪群體的遺傳多樣性最高，其野生資源也相對豐富.野生資源是遺傳多樣性的重要來源，還可能蘊藏著珍貴的基因資源，應(yīng)加強系統(tǒng)研究和科學(xué)保護；其次在根據(jù)怒江州深紋核桃資源群體遺傳分化特征進行選育和保護工作時，應(yīng)在選擇遺傳多樣性高的群體基礎(chǔ)上，側(cè)重于群體內(nèi)家系和單株的選擇，以盡可能地保存和利用好該區(qū)域的多樣性.