陳琴，曲延英，倪志勇，韓玉慧，程浩然，陳全家

（新疆農業(yè)大學農學院/ 新疆農業(yè)大學農業(yè)技術重點實驗室，烏魯木齊830052）

我國新疆及長江流域夏秋季節(jié)常晴熱少雨，嚴重影響棉花的產量和品質。為了抵抗干旱（鹽）脅迫，棉花進化出了響應脅迫的復雜代謝通路，從而實現(xiàn)抗（耐）逆反應[1-2]，而大部分脅迫應答基因的轉錄激活和抑制是通過轉錄因子的調控實現(xiàn)的[3]。對棉花轉錄因子的研究有助于揭示棉花應對非生物脅迫的生理和分子機制[4-5]。

AP2 （Apetala 2）/ERF 轉錄因子家族是1 個龐大的家族，參與了植物細胞的生長發(fā)育以及逆境脅迫等多個代謝過程的調節(jié)[6-7]。該家族基因首先于1994年在擬南芥中被分離，參與擬南芥花和種子的發(fā)育調控[8]。隨后在煙草中也發(fā)現(xiàn)了4 個可以結合GCC-box 的蛋白，可以受到乙烯的誘導，因此被命名為乙烯反應元件結合蛋白（Ethylene-responsive element binding proteins，EREBPs），也稱為乙烯響應因子（Ethylene response factors，ERF）[9]。在棉花中，Shaheen 等[10]研究表明，GaDREB基因在水分脅迫90 min 后表達量最高，并能夠與NAC、MYB、AREB、ABRE 和DRE/CRT 相互作用，它們通過脫落酸途徑參與棉花各種干旱脅迫反應。HRD基因是AP2/ERF轉錄因子基因家族的成員。據(jù)Karaba 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下，過表達擬南芥HRD基因可以增加水稻（Oryza sativa）根的分枝，提高葉片光合同化作用效率，從而通過增強水稻水分利用率來提高水稻的抗旱性。Abogadallah 等[12]研究表明，在埃及三葉草（Trifolium alexandrinumL.）中過表達HRD基因，可降低三葉草蒸騰速率，保護光合作用系統(tǒng)，從而增強水分利用率。對干旱脅迫下轉線果芥（Conringia planisiliquaL.）HRD基因煙草與野生型煙草的7 項生理指標及形態(tài)、氣孔變化對比分析，發(fā)現(xiàn)轉基因煙草獲得了比野生型煙草更好的抗旱能力[13]。但目前關于HRD轉錄因子基因在棉花抗逆過程中的生理和分子機制尚不清楚。因此，本研究利用pET 原核表達系統(tǒng)成功表達了GhHRD 重組蛋白，并分析了其亞細胞定位和轉錄激活功能，這些研究的開展有助于進一步闡明GhHRD基因參與棉花抗逆的分子機制。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本實驗室前期鑒定了8 份陸地棉品種 （系）的抗旱及耐鹽水平，結果顯示它們綜合抗逆水平排序為新陸中 36 號＞Y1169 ＞10615-3 ＞ND359-5＞CQJ-5＞KK1543＞新炮1 號＞新陸早26 號[14]。因此，選擇新陸中36 號作為試驗材料。

1.2 載體和試劑

pET-28a（＋）、pCAMBIA1304、pGBKT7、BL21（DE3）、EHA105、酵母菌AH109、大腸桿菌DH5α感受態(tài)、pEASY-T1 Simple Cloning Kit 購自北京全式金生物技術有限公司；蛋白胨、酵母提取物、氨芐青霉素購自寶信生物科技公司；反轉錄試劑盒、限制性內切酶BamHⅠ、SalⅠ、NcoⅠ和SpeⅠ、T4DNA 連接酶、YPDA 培養(yǎng)基、SD/-Trp 培養(yǎng)基、SD/-Trp/-His/-Ade 營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基購自賽默飛世爾科技有限公司；質粒DNA 提取試劑盒、瓊脂糖回收試劑盒、Taq酶、dNTP、DNA marker 購自天根生化科技有限公司；利福平、異丙基-β-D- 硫代半乳糖苷（IPTG）購自北京索萊寶科技有限公司；引物合成和測序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.3 基因的克隆

根據(jù)NCBI 提供的擬南芥HRD基因核苷酸序列（登錄號：NM_129202.1）設計聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）引物，以新陸中36 號的cDNA 為模板，以包含開放閱讀框的引物（P1：5'-GGATCCATGCATTACTCCAAACCCAA-3'，P2：5'-GTCGACTTAAGGGAATTTCCAGAGGTT-3'，其中下劃線部分依次是BamHⅠ和SalⅠ酶切位點） 擴增目的基因。PCR 體系為10×TaqBuffer 2.0 μL、2.5 μmol·L－1dNTP 2 μL、TaqDNA 聚合酶0.4 μL、10 μmol·L－1上下游引物各0.4 μL、cDNA 2 μL、dd H2O 補足至20 μL。反應程序為95 ℃5 min，95 ℃40 s，52 ℃40 s，72℃1 min，35 個循環(huán)后72 ℃10 min。PCR 產物經(jīng)1%（質量分數(shù)） 瓊脂糖凝膠電泳回收純化后，與pEASY-T1 Simple Cloning Kit 載體連接，鑒定陽性克隆，送上海生工生物工程有限公司測序。

1.4 生物信息學分析

采用Protscale（http://web.expasy.org/protscale/）推測蛋白質理化性質；ExPASy（http://prosite.expasy.org/）分析結構域；用DNAMAN 軟件進行蛋白多序列比對；利用SWISS-MODEL 進行蛋白建模 （https://www.swissmodel.expasy.org/）；用Clustal X 和MEGA 5.0 完成多種氨基酸序列比對及相關蛋白的同源樹構建。

1.5 原核表達分析

將陽性質粒和載體pET-28a(＋)分別用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切，連接、轉化Escherichia coli/DH5a 感受態(tài)細胞后測序。選陽性pET-28a(＋)-GhHRD 質粒與空載體分別轉化E.coli/BL21（DE3）感受態(tài)細胞，各挑取單菌落于50 mL 含卡那霉素（100 mg·L－1）的LB 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h。次日取0.05 mL 接菌至5 mL 抗性LB 培養(yǎng)基中，于37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.5，各取1 mL 菌液，12 000 r·min－1離心1 min，收集沉淀為對照。剩余的菌液進行原核表達體系優(yōu)化：（1）誘導時間的優(yōu)化。選定終濃度1 mmol·L－1IPTG、37 ℃誘導，分別在0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、24 h取樣。（2）IPTG 濃度的優(yōu)化。選定時間4 h、溫度37 ℃，分別用0.01 mmol·L－1、0.05 mmol·L－1、0.1 mmol·L－1、0.5 mmol·L－1、1.0 mmol·L－1和2.0 mmol·L－1IPTG 進行誘導。（3）誘導溫度的優(yōu)化。IPTG 濃度0.05 mmol·L－1，時間4 h，分別在25℃、30 ℃、37 ℃條件下誘導。收集的每管菌沉淀加入1 mL 1×十二烷基硫酸鈉（SDS）凝膠上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min，進行SDS- 聚丙烯酰胺凝膠電泳，并通過濕轉轉到聚偏氟乙烯膜（PVDF）上進行Western Blotting 分析。

1.6 亞細胞定位分析

設計帶有NcoⅠ和SpeⅠ位點的引物（P3：5'-CCATGGATGCATTACTCCAAACCCAA-3'，P4：5'-ACTAGTTTAAGGGAATTTCCAGAGGTTAT-3'），將GhHRD基因插入pCAMBIA1304 載體35S 啟動子和GFP之間，構建pCAMBIA1304-GhHRD-GFP 瞬時表達載體。采用凍融法將載體導入農桿菌EHA105 菌株。將該菌株活化OD600為0.5，5 000 r·min－1離心10 min 棄上清液，用含有10 mmoL·L－1MgCl2和100 μmol·L－1乙酰丁香酮的MS 液體培養(yǎng)基重懸菌體細胞。將預培養(yǎng)后的第5 層洋蔥表皮放入重懸液中浸泡30 min，再轉入含有100 μmol·L－1AS 的MS 固體培養(yǎng)基中，25 ℃暗培養(yǎng)28 h，在正置熒光顯微鏡下觀察GFP 信號，確定其亞細胞定位。以pCAMBIA1304-GFP 為對照。

1.7 轉錄激活功能驗證分析

用帶有NcoⅠ和SalⅠ位點的引物 （上游：P3、 下游：P2），將GhHRD基因片段插入pGBKT7 載體，并轉化酵母AH109 細胞。將帶有pGBKT7 對照載體及鑒定為陽性的 pGBKT7-GhHRD 載體的酵母菌活化，分別涂布在SD/-Trp 營養(yǎng)單缺型培養(yǎng)基和SD/-Trp/-His/-Ade營養(yǎng)缺陷型（三缺）培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d 后，觀察酵母生長情況。

2 結果與分析

2.1 GhHRD 基因的克隆與分析

以新陸中36 號的cDNA 為模板，利用反轉錄-PCR 得1 條開放閱讀框為555 bp 的核酸序列（圖1）。經(jīng)在線軟件ExPASy 分析，該序列編碼184 個氨基酸，等電點為5，相對分子質量約為19.539 kDa。位于第27～84 氨基酸處有1 個AP2-ERF 功能結構域（圖2A），三維結構預測發(fā)現(xiàn)該蛋白由3 個β- 折疊、3 個α- 螺旋和無規(guī)則卷曲組成（圖2B）。

圖1 GhHRD基因RT-PCR電泳圖Fig.1 RT-PCR products of GhHRD gene

圖2 GhHRD基因結構分析Fig.2 Bioinformatics analysis results of GhHRD

經(jīng)Blast 比對，篩選出9 條與GhHRD 相似性較高的蛋白序列，DNAMAN 多序列比對發(fā)現(xiàn)各物種HRD 蛋白的AP2-ERF 結構域 （圖3 紅框） 序列高度保守，GhHRD 蛋白AP2-ERF 結構域的第14 位為纈氨酸，第19 位為谷氨酸（圖3箭頭）。

圖3 GhHRD蛋白與其他物種HRD蛋白多序列比對Fig.3 Multiple sequence alignment of GhHRD and HRD proteins from other plant

用MEGA5.0 軟件鄰近連接法（Neighbor-Joining，NJ） 對陸地棉 （Gossypium hirsutumL.）、亞洲棉（G.arboreumL.）、雷蒙德氏棉（G.raimondiiL.）、榴蓮（Durio zibethinus）、黃麻（Corchorus capsularisL.）、可可（Theobroma cacaoL.）、埃及錦葵（Corchorus olitoriusL.）、橡膠樹（Hevea brasiliensis）、 木薯（Manihot esculenta）、 擬南芥（Arabidopsis thaliana）中的HRD 蛋白序列構建生物系統(tǒng)發(fā)育樹。圖4 結果顯示，GhHRD 與亞洲棉、雷蒙德氏棉中HRD 蛋白的親緣關系最近。

圖4 HRD蛋白的系統(tǒng)進化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of HRD

2.2 GhHRD蛋白原核表達分析

用引物P1、P2 將GhHRD插入到原核表達載體pET-28a（＋），重組質粒經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定后，瓊脂糖凝膠電泳顯示酶切小片段為555 bp 左右（圖5），且測序結果與目的序列完全一致，表明pET-28a（＋）-GhHRD 原核表達載體構建成功。

用構建好的重組質粒與pET-28a（＋）空載體分別轉化BL21（DE3）感受態(tài)細胞，對重組工程菌BL21/pET-28a（＋）-GhHRD 進行IPTG 誘導表達，以BL21/pET-28a（＋）為陰性對照。如圖6，電泳結果顯示，在20 kDa～26 kDa 之間有特異條帶，由于重組蛋白His 標簽蛋白及相關序列大小約4.8 kDa，因此所表達的蛋白條帶大小與GhHRD 預測的19.539 kDa 基本吻合，說明該重組工程菌可以按試驗設計正確表達目的蛋白。經(jīng)誘導條件優(yōu)化試驗，最終發(fā)現(xiàn)在25 ℃，0.05 mmol·L－1IPTG 誘導4 h 最佳。將誘導表達的重組蛋白進行Western 印跡分析，在約24 kDa 處出現(xiàn)特異性抗原- 抗體結合帶，進一步說明GhHRD 重組蛋白能夠表達。

圖5 原核表達載體pET-28a（＋）-GhHRD雙酶切鑒定Fig.5 Identification of recombinant plasmid by double enzyme digestion

圖6 GhHRD重組蛋白原核表達及Western blotting鑒定Fig.6 Prokaryotic expression and Western blotting analysis of recombinant GhHRD protein

2.3 亞細胞定位分析

用引物P3、P4 構建pCAMBIA1304-GhHRDGFP 瞬時表達載體，雙酶切和測序結果顯示載體構建成功。亞細胞定位結果表明，GhHRD-GFP 融合蛋白熒光信號主要集中于細胞核（圖7），該結果驗證了生物信息學的預測結果，GhHRD 是1個核蛋白。

圖7 GhHRD在洋蔥表皮中的定位Fig.7 Subcellular localization of GhHRD fusion protein in onion epidermal cells

2.4 轉錄激活功能驗證分析

GhHRD為轉錄因子基因，為驗證其是否具有轉錄激活作用，以pGBKT7 載體為陰性對照，將目標基因轉化AH109 酵母感受態(tài)細胞。如圖8所示，二者在酵母單缺培養(yǎng)基SD/-Trp 中生長狀態(tài)一致，而在三缺培養(yǎng)基SD/-Trp/-His/-Ade 上，轉入pGBKT7-GhHRD 的酵母菌株可以正常生長，陰性對照無法生長。說明效應基因都能夠正常表達，激活了下游的報告基因，使其能夠在His 和Ade 缺陷培養(yǎng)基中正常生長。這說明，GhHRD 融合蛋白對酵母菌株無毒性，GhHRD基因具備轉錄自激活功能，驗證了GhHRD 是轉錄因子。

圖8 GhHRD轉錄激活活性分析Fig.8 Transcriptional activation analysis of GhHRD

3 討論

AP2/ERF 轉錄因子家族含有1 個由60～70個氨基酸組成的保守的AP2/ERF 結構域。依據(jù)結構域的數(shù)量，AP2/ERF 家族可以分為4 個亞族，分別是含2 個結構域的AP2 亞族、1 個結構域的干旱應答元件結合蛋白（Dehydration-responsive element-binding protein，DREB） 亞族和ERF亞族、1 個結構域和1 個B3 結構域的RAV（Related to ABI3/VP1）亞族，其中DREB 亞族在保守域的第14 位都具有保守的纈氨酸 （V14），在第19 位都有谷氨酸（E19），而ERF 亞族在第14 位為丙氨酸（A14），第19 位為天冬氨酸（D19），但也有例外[15]。本試驗克隆的GhHRD基因編碼產物含有1 個AP2/ERF 結構域且在第14 位為纈氨酸，第19 位為谷氨酸，因此GhHRD 屬于AP2/ERF 轉錄因子家族的DREB 亞組。

干旱應答元件結合蛋白（DREB）能夠專一性識別順式作用元件DRE （Dehydration responsive element）/CRT（C-repeat），主要在干旱和冷誘導的響應過程中發(fā)揮作用[16]。研究發(fā)現(xiàn)，在低溫和干旱脅迫的試驗中，轉DREB1 基因的擬南芥植株生長良好，而對照組全部死亡[17]。Liu 等[18]發(fā)現(xiàn)桑樹DREB4a基因在干旱、NaCl、 低溫和高熱處理后表達增高，過表達DREB4a基因的煙草根長和株高明顯高于野生型，且具有更強的耐旱性和耐鹽性。Huang 等[19-21]在棉花中克隆了GhDBP2、GhDBP3 基因和GhDREB1L基因，RT-PCR 顯示該基因在低溫、 干旱和鹽脅迫下高效表達。Liu等[22]對棉花轉錄組進行分析，在雷蒙德氏棉中共鑒定出269 個AP2/ERF 類轉錄因子基因，在陸地棉TM-1 中鑒定出504 個，其中151 個非重復的DREB 和ERF 亞家族基因對不同脅迫有反應：132 個基因受寒冷誘導，63 個基因受干旱誘導，94 個基因受熱誘導。實時熒光定量PCR 證實13 個GhDREB和15 個GhERF基因受冷和/ 或干旱誘導?？梢?，DREB 類轉錄因子基因在植物抗逆過程中扮演重要角色，由此推測GhHRD基因可能在棉花逆境脅迫應答反應中扮演重要角色。但目前關于棉花DREB 類轉錄因子基因GhHRD的克隆和功能驗證還未見報道。

4 結論

本研究從陸地棉中克隆了1 個AP2/ERF 家族DREB 類轉錄因子基因GhHRD，能夠經(jīng)原核表達載體正確誘導表達。該基因編碼產物定位于細胞核且具有明顯轉錄自激活功能。通過生物信息學分析推測該基因可能參與了棉花逆境脅迫應答過程，但它在棉花逆境脅迫中的作用及其機理還有待于進一步研究。